Proteómica cuantitativa
Técnica de química analítica
Espectrometría de masas cuantitativa.

La proteómica cuantitativa es una técnica de química analítica para determinar la cantidad de proteínas en una muestra. [1] [2] [3] [4] Los métodos para la identificación de proteínas son idénticos a los utilizados en la proteómica general (es decir, cualitativa) , pero incluyen la cuantificación como una dimensión adicional. En lugar de simplemente proporcionar listas de proteínas identificadas en una determinada muestra, la proteómica cuantitativa proporciona información sobre las diferencias fisiológicas entre dos muestras biológicas. Por ejemplo, este enfoque se puede utilizar para comparar muestras de pacientes sanos y enfermos. La proteómica cuantitativa se realiza principalmente mediante electroforesis en gel bidimensional (2-DE), PAGE nativa preparativa o espectrometría de masas (MS). Sin embargo, un método desarrollado recientemente de análisis de transferencia de puntos cuantitativos (QDB) puede medir tanto la cantidad absoluta como la relativa de proteínas individuales en la muestra en un formato de alto rendimiento, abriendo así una nueva dirección para la investigación proteómica. A diferencia de la 2-DE, que requiere MS para la identificación de proteínas posterior, la tecnología MS puede identificar y cuantificar los cambios.

Cuantificación mediante espectrofotometría

La concentración de una determinada proteína en una muestra se puede determinar utilizando procedimientos espectrofotométricos. [5] La concentración de una proteína se puede determinar midiendo la DO a 280 nm en un espectrofotómetro, que se puede utilizar con un ensayo de curva estándar para cuantificar la presencia de triptófano, tirosina y fenilalanina. [6] Sin embargo, este método no es el más preciso porque la composición de las proteínas puede variar en gran medida y este método no podría cuantificar proteínas que no contengan los aminoácidos mencionados anteriormente. Este método también es inexacto debido a la posibilidad de contaminación con ácidos nucleicos. Otros procedimientos espectrofotométricos más precisos para la cuantificación de proteínas incluyen los métodos de Biuret , Lowry , BCA y Bradford . Un método alternativo para la cuantificación de proteínas sin etiqueta en líquido transparente es la técnica SPR basada en cubeta , que mide simultáneamente el índice de refracción que varía de 1,0 a 1,6 nD y la concentración de la proteína que varía de 0,5 μL a 2 mL en volumen. Este sistema consiste en un filtro óptico calibrado con una resolución angular muy alta y la interacción de la luz con este cristal forma una resonancia en una longitud de onda que se correlaciona con la concentración y el índice de refracción cerca del cristal. [7]

Cuantificación mediante electroforesis bidimensional

La electroforesis en gel bidimensional (2-DE) representa una de las principales tecnologías para la proteómica cuantitativa con ventajas y desventajas. La 2-DE proporciona información sobre la cantidad de proteína, la carga y la masa de la proteína intacta. Tiene limitaciones para el análisis de proteínas mayores de 150 kDa o menores de 5 kDa y proteínas de baja solubilidad. La MS cuantitativa tiene mayor sensibilidad pero no proporciona información sobre la proteína intacta.

La electroforesis en gel de diferencia (DIGE) clásica basada en tinción con colorante post-electroforético tiene limitaciones: se requieren al menos tres réplicas técnicas para verificar la reproducibilidad. [ cita requerida ] La electroforesis en gel de diferencia (DIGE) utiliza el etiquetado basado en fluorescencia de las proteínas antes de la separación, lo que ha aumentado la precisión de la cuantificación, así como la sensibilidad en la detección de proteínas. [ cita requerida ] Por lo tanto, la DIGE representa el enfoque principal actual para el estudio de proteomas basado en 2-DE. [ cita requerida ]

Cuantificación mediante espectrometría de masas

Ejemplos de flujos de trabajo proteómicos cuantitativos. El rojo representa la muestra fisiológica de interés, mientras que el azul representa la muestra de control. Los recuadros blancos representan las áreas en las que es más probable que se produzcan errores y los recuadros morados representan los lugares en los que se han mezclado las muestras. [8]

La espectrometría de masas (MS) representa una de las principales tecnologías para la proteómica cuantitativa con ventajas y desventajas. [4] La MS cuantitativa tiene una mayor sensibilidad pero puede proporcionar solo información limitada sobre la proteína intacta. La MS cuantitativa se ha utilizado tanto para el descubrimiento como para el análisis proteómico dirigido para comprender la dinámica proteómica global en poblaciones de células (análisis masivo) [9] o en células individuales (análisis de células individuales). [10] [11]

Los primeros enfoques desarrollados en la década de 1990 aplicaron etiquetas de afinidad codificadas por isótopos (ICAT), que utilizan dos reactivos con isótopos pesados ​​y ligeros, respectivamente, y una etiqueta de afinidad de biotina para modificar péptidos que contienen cisteína. Esta tecnología se ha utilizado para etiquetar células completas de Saccharomyces cerevisiae [12] y, junto con la espectrometría de masas , ayudó a sentar las bases de la proteómica cuantitativa. Este enfoque ha sido reemplazado por las etiquetas de masa isobáricas [9] , que también se utilizan para el análisis de proteínas de una sola célula [13] .

Cuantificación relativa y absoluta

La espectrometría de masas no es inherentemente cuantitativa debido a las diferencias en la eficiencia de ionización y/o detectabilidad de los muchos péptidos en una muestra dada, lo que ha provocado el desarrollo de métodos para determinar la abundancia relativa y absoluta de proteínas en las muestras. [3] [4] La intensidad de un pico en un espectro de masas no es un buen indicador de la cantidad de analito en la muestra, aunque las diferencias en la intensidad del pico del mismo analito entre múltiples muestras reflejan con precisión las diferencias relativas en su abundancia.

Marcaje de isótopos estables en espectrometría de masas

Etiquetas de isótopos estables

Un método de cuantificación relativa que es más costoso y requiere más tiempo, aunque es menos sensible al sesgo experimental que la cuantificación sin etiquetas, implica etiquetar las muestras con etiquetas de isótopos estables que permiten al espectrómetro de masas distinguir entre proteínas idénticas en muestras separadas. Un tipo de etiqueta, las etiquetas isotópicas, consisten en isótopos estables incorporados en reticuladores de proteínas que causan un cambio de masa conocido de la proteína o péptido marcado en el espectro de masas. Las muestras marcadas diferencialmente se combinan y se analizan juntas, y las diferencias en las intensidades de pico de los pares de isótopos reflejan con precisión la diferencia en la abundancia de las proteínas correspondientes.

La cuantificación proteómica absoluta con péptidos isotópicos implica la adición de concentraciones conocidas de isotopólogos sintéticos pesados ​​de péptidos diana a una muestra experimental y luego realizar LC-MS/MS. Al igual que con la cuantificación relativa con marcadores isotópicos, los péptidos de igual química coeluyen y se analizan por MS simultáneamente. Sin embargo, a diferencia de la cuantificación relativa, la abundancia del péptido diana en la muestra experimental se compara con la del péptido pesado y se retrocalcula a la concentración inicial del estándar utilizando una curva estándar predeterminada para obtener la cuantificación absoluta del péptido diana.

Los métodos de cuantificación relativa incluyen etiquetas de afinidad codificadas por isótopos (ICAT), etiquetado isobárico ( etiquetas de masa en tándem (TMT) y etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ)), etiquetas codificadas por metales para cuantificación sin etiquetas ( MeCAT ), etiquetado N-terminal, etiquetado de isótopos estables con aminoácidos en cultivo celular ( SILAC ) y etiquetado isotópico de amina terminal de sustratos (TAILS). Ha surgido un enfoque matemáticamente riguroso que integra las intensidades de los péptidos y el acuerdo de medición de péptidos en intervalos de confianza para las proporciones de proteínas. [14]

La cuantificación absoluta se realiza mediante el método de monitorización de reacciones seleccionadas (SRM).

Etiquetas con código de metal

El método de etiquetas con códigos de metales (MeCAT) se basa en el etiquetado químico, pero en lugar de utilizar isótopos estables, se utilizan diferentes iones lantánidos en complejos macrocíclicos. La información cuantitativa proviene de mediciones de MS de plasma acoplado inductivamente de los péptidos marcados. MeCAT se puede utilizar en combinación con espectrometría de masas elemental ICP-MS, lo que permite la cuantificación absoluta por primera vez del metal unido por el reactivo MeCAT a una proteína o biomolécula. Por lo tanto, es posible determinar la cantidad absoluta de proteína hasta el rango de attomoles utilizando una calibración externa con una solución estándar de metal. Es compatible con la separación de proteínas mediante electroforesis 2D y cromatografía en experimentos multiplex. La identificación de proteínas y la cuantificación relativa se pueden realizar mediante MALDI -MS/MS y ESI-MS/MS.

Los espectrómetros de masas tienen una capacidad limitada para detectar péptidos de baja abundancia en muestras con un rango dinámico alto. El ciclo de trabajo limitado de los espectrómetros de masas también restringe la tasa de colisión, lo que da como resultado un submuestreo. [15] Los protocolos de preparación de muestras representan fuentes de sesgo experimental.

Marcaje de isótopos estables con aminoácidos en cultivos celulares

El marcaje de isótopos estables con aminoácidos en cultivos celulares ( SILAC ) es un método que implica la incorporación metabólica de aminoácidos marcados con C o N “pesados” en proteínas, seguido de un análisis por MS. SILAC requiere el crecimiento de células en medios especializados suplementados con formas ligeras o pesadas de aminoácidos esenciales, lisina o arginina. Una población celular se cultiva en medios que contienen aminoácidos ligeros, mientras que la condición experimental se cultiva en presencia de aminoácidos pesados. Los aminoácidos pesados ​​y ligeros se incorporan a las proteínas a través de la síntesis de proteínas celulares. Después de la lisis celular, se combinan cantidades iguales de proteínas de ambas condiciones y se someten a digestión proteotípica. Se eligieron los aminoácidos arginina y lisina porque la tripsina, la enzima predominante utilizada para generar péptidos proteotípicos para el análisis por MS, escinde en el extremo C de la lisina y la arginina. Tras la digestión con tripsina, todos los péptidos tripsínicos de las células cultivadas en medios SILAC tendrían al menos un aminoácido marcado, lo que daría como resultado un cambio de masa constante de la muestra marcada con respecto a la no marcada. Debido a que los péptidos que contienen aminoácidos pesados ​​y ligeros son químicamente idénticos, coeluyen durante el fraccionamiento en columna de fase inversa y se detectan simultáneamente durante el análisis de espectrometría de masas. La abundancia relativa de proteínas está determinada por las intensidades de pico relativas de los péptidos isotópicamente distintos.

Tradicionalmente, el nivel de multiplexación en SILAC estaba limitado debido a la cantidad de isótopos SILAC disponibles. Recientemente, una nueva técnica llamada NeuCode SILAC, [16] ha aumentado el nivel de multiplexación alcanzable con el etiquetado metabólico (hasta 4). El método de aminoácidos de NeuCode es similar a SILAC, pero se diferencia en que el etiquetado solo utiliza aminoácidos pesados. El uso de solo aminoácidos pesados ​​elimina la necesidad de la incorporación del 100% de los aminoácidos necesarios para SILAC. La mayor capacidad de multiplexación de los aminoácidos de NeuCode se debe al uso de defectos de masa de neutrones adicionales en los isótopos estables. Sin embargo, estas pequeñas diferencias de masa deben resolverse en espectrómetros de masas de alta resolución.

Uno de los principales beneficios de SILAC es que el nivel de sesgo de cuantificación debido a errores de procesamiento es bajo porque las muestras pesadas y livianas se combinan antes de la preparación de la muestra para el análisis de MS. SILAC y NeuCode SILAC son excelentes técnicas para detectar pequeños cambios en los niveles de proteína o modificaciones postraduccionales entre grupos experimentales.

Etiquetado isobárico

Las etiquetas de masa isobárica (etiquetas de masa en tándem) son etiquetas que tienen propiedades químicas y de masa idénticas que permiten que los isotólogos pesados ​​y ligeros coeluyan juntos. Todas las etiquetas de masa consisten en un indicador de masa que tiene un número único de sustituciones de 13 C, un normalizador de masa que tiene una masa única que equilibra la masa de la etiqueta para que todas las etiquetas tengan la misma masa y una fracción reactiva que se enlaza a los péptidos. Estas etiquetas están diseñadas para escindirse en una región de enlace específica tras una difracción de imagen de alta energía (CID), lo que produce etiquetas de diferentes tamaños que luego se cuantifican mediante LC-MS/MS. Las muestras de proteínas o péptidos preparadas a partir de células, tejidos o fluidos biológicos se etiquetan en paralelo con las etiquetas de masa isobárica y se combinan para su análisis. La cuantificación de proteínas se logra comparando las intensidades de los iones indicadores en los espectros MS/MS. Hay tres tipos de etiquetas de masa en tándem disponibles con diferente reactividad: (1) éster NHS reactivo que proporciona un etiquetado específico de amina de alta eficiencia (TMTduplex, TMTsixplex, TMT10plex y TMT11plex), (2) grupo funcional iodacetilo reactivo que etiqueta grupos sulfhidrilo-(-SH) (iodoTMT) y (3) grupo funcional alcoxiamina reactivo que proporciona etiquetado covalente de compuestos que contienen carbonilo (aminoxyTMT).

Una ventaja clave del etiquetado isobárico en comparación con otras técnicas de cuantificación (por ejemplo, SILAC, ICAT, Label-free) es la mayor capacidad de multiplexación y, por lo tanto, el mayor potencial de rendimiento. La capacidad de combinar y analizar varias muestras simultáneamente en una ejecución de LC-MS elimina la necesidad de analizar múltiples conjuntos de datos y elimina la variación de una ejecución a otra. El multiplexado reduce la variabilidad del procesamiento de las muestras, mejora la especificidad al cuantificar las proteínas de cada condición simultáneamente y reduce el tiempo de respuesta para múltiples muestras. Las etiquetas químicas isobáricas disponibles actualmente facilitan el análisis simultáneo de hasta 11 muestras experimentales.

Cuantificación sin etiquetas en espectrometría de masas

Un enfoque para la cuantificación relativa es analizar muestras por separado mediante espectrometría de masas y comparar los espectros para determinar la abundancia de péptidos en una muestra en relación con otra, como en las estrategias sin etiquetas . En general, se acepta que, si bien la cuantificación sin etiquetas es el paradigma de cuantificación menos preciso, también es económico y confiable cuando se lo somete a una validación estadística rigurosa. Existen dos métodos diferentes de cuantificación en la proteómica cuantitativa sin etiquetas: AUC (área bajo la curva) y recuento espectral.

Métodos de cuantificación sin etiquetas

El AUC es un método por el cual, para un espectro de péptidos dado en una ejecución de LC-MS, se calcula el área bajo el pico espectral. Las mediciones del pico AUC son linealmente proporcionales a la concentración de proteína en una mezcla de analitos dada. La cuantificación se logra a través de recuentos de iones, la medición de la cantidad de un ion en un tiempo de retención específico. [17] Se requiere discreción para la estandarización de los datos sin procesar. [18] El espectrómetro de alta resolución puede aliviar los problemas que surgen cuando se intenta hacer que los datos sean reproducibles, sin embargo, gran parte del trabajo relacionado con la normalización de los datos se puede realizar a través de software como OpenMS y MassView. [19]

El recuento espectral implica contar los espectros de una proteína identificada y luego estandarizarlos utilizando alguna forma de normalización. [20] Por lo general, esto se hace con una selección de masas de péptidos abundantes (MS) que luego se fragmenta y luego se cuentan los espectros MS/MS. [17] Se requieren múltiples muestreos del pico de proteína para una estimación precisa de la abundancia de proteína debido a la naturaleza fisicoquímica compleja de los péptidos. Por lo tanto, la optimización para experimentos MS/MS es una preocupación constante. Una alternativa para evitar este problema es utilizar una técnica independiente de los datos que alterna entre energías de colisión altas y bajas. De este modo, se recopila un gran estudio de todos los posibles iones precursores y productos. Sin embargo, esto está limitado por la capacidad del software de espectrometría de masas para reconocer y hacer coincidir los patrones de péptidos de asociaciones entre los iones precursores y productos.

Aplicaciones

Flujo de trabajo de la cuantificación de las diferencias fisiológicas en las células α y β en ratones mediante predicción por ordenador (A) y cuantificación mediante etiqueta isotópica SILAC (B). (C) es la lista de candidatos de quinasas que indican diferencias fisiológicas en las células α y β. [21]

Aplicaciones biomédicas

La proteómica cuantitativa tiene distintas aplicaciones en el campo médico, especialmente en los campos del descubrimiento de fármacos y biomarcadores. Las técnicas LC-MS/MS han comenzado a reemplazar a métodos más tradicionales como el Western blot y ELISA debido a la naturaleza engorrosa de etiquetar y separar proteínas diferentes utilizando estos métodos y al análisis más global de la cuantificación de proteínas. Los métodos de espectrometría de masas son más sensibles a las diferencias en la estructura de las proteínas, como la modificación postraduccional, y por lo tanto pueden cuantificar diferentes modificaciones de las proteínas. La proteómica cuantitativa puede evitar estos problemas, ya que solo necesita que se realice la información de la secuencia. Se puede aplicar a nivel global del proteoma o al aislamiento específico de los socios de unión en experimentos de purificación por afinidad o pull-down. [4] [22] Sin embargo, se deben tener en cuenta las desventajas en la sensibilidad y el tiempo de análisis. [23]

Descubrimiento de fármacos

La proteómica cuantitativa tiene las mayores aplicaciones en la identificación de dianas proteicas, la validación de dianas proteicas y el perfil de toxicidad del descubrimiento de fármacos . [24] El descubrimiento de fármacos se ha utilizado para investigar la interacción proteína-proteína y, más recientemente, las interacciones fármaco-molécula pequeña, un campo de estudio llamado quimioproteómica . Por lo tanto, ha demostrado ser muy prometedor en el seguimiento de los efectos secundarios de pequeñas moléculas similares a fármacos y en la comprensión de la eficacia y el efecto terapéutico de una diana farmacológica sobre otra. [25] [26] Una de las metodologías más típicas para la cuantificación absoluta de proteínas en el descubrimiento de fármacos es el uso de LC-MS/MS con monitorización de reacciones múltiples (MRM). La espectrometría de masas se realiza normalmente mediante un MS de triple cuadrupolo . [24]

Véase también

Referencias

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