Precipitación de etanol

La precipitación con etanol es un método utilizado para purificar y/o concentrar ARN , ADN y polisacáridos como pectina y xiloglucano a partir de soluciones acuosas agregando sal y etanol como antidisolvente.

En la extracción de ADN, después de separar el ADN de otros componentes celulares en agua, el ADN se precipita fuera de la solución neutralizándolo con iones de carga positiva. La adición de etanol a la solución es necesaria para reducir la polaridad del solvente y permitir que los iones de carga positiva interactúen con los grupos de fosfato de carga negativa del ADN.

El ADN se separa normalmente de los demás componentes celulares en una solución bifásica de fenol y agua. Debido a su estructura de fosfato altamente cargada , el ADN es polar y se concentra en la fase acuosa, mientras que los lípidos y las proteínas se concentran en la fase fenólica.

Para precipitar el ADN fuera del agua, los grupos fosfato con carga negativa de la cadena principal del ADN se neutralizan mediante la adición de iones con carga positiva de una sal. Pero debido a la alta polaridad del agua, ilustrada por su alta constante dieléctrica de 80,1 (a 20 °C), los iones con carga positiva están protegidos y no pueden interactuar con los grupos fosfato con carga negativa del ADN ni neutralizarlos. ^[1]

Esta relación se refleja en la ley de Coulomb , que puede utilizarse para calcular la fuerza que actúa sobre dos cargas separadas por una distancia utilizando la constante dieléctrica (también llamada permitividad estática relativa) del medio en el denominador de la ecuación ( es una constante eléctrica ):$estilo de visualización q_{1}}$$estilo de visualización q_{2}$${\estilo de visualización r}$${\displaystyle \varepsilon _{r}}$${\displaystyle \varepsilon _{0}}$

${\displaystyle F={\frac {1}{4\pi \varepsilon _ {r}\varepsilon _ {0}}}{\frac {q_ {1}q_ {2}}{r^{2}}} }$

A nivel atómico, la reducción de la fuerza que actúa sobre una carga se debe a que las moléculas de agua forman una capa de hidratación a su alrededor. Este hecho hace que el agua sea un disolvente muy bueno para compuestos cargados como las sales.

El etanol es mucho menos polar que el agua, con una constante dieléctrica de 24,3 (a 25 °C). Esto significa que añadir etanol a una solución altera el filtrado de cargas por parte del agua. Si se añade suficiente etanol, la atracción eléctrica entre los grupos fosfato y los iones positivos presentes en la solución se vuelve lo suficientemente fuerte como para formar enlaces iónicos estables que hacen que el ADN se precipite fuera de la solución. Esto suele ocurrir cuando el etanol compone más del 64 % de la solución. Como sugiere el mecanismo, la solución tiene que contener iones positivos para que se produzca la precipitación; normalmente, este papel lo desempeñan Na ⁺ , NH4 ₊ ^o Li ⁺ . ^[2]

El ADN se precipita asegurándose primero de que la concentración correcta de iones positivos esté presente en la solución (demasiado dará como resultado una gran cantidad de sal coprecipitando con el ADN, muy poco dará como resultado una recuperación incompleta del ADN) y luego agregando dos a tres volúmenes de al menos 95% de etanol. Muchos protocolos recomiendan almacenar el ADN a baja temperatura en este punto, pero también hay observaciones de que puede no mejorar la recuperación del ADN e incluso puede reducir la eficiencia de la precipitación mientras se usa el tiempo de incubación durante la noche. ^{[3] [4]} Por lo tanto, se puede lograr una buena eficiencia a temperatura ambiente, pero cuando se tiene en cuenta la posible degradación, probablemente sea mejor incubar el ADN en hielo húmedo. El tiempo de incubación óptimo depende de la longitud y la concentración del ADN. Los fragmentos más pequeños y las concentraciones más bajas requerirán tiempos más largos para lograr una recuperación aceptable. Para longitudes muy pequeñas y concentraciones bajas, se recomienda la incubación durante la noche. En tales casos, el uso de portadores como ARNt , glucógeno o poliacrilamida lineal puede mejorar en gran medida la recuperación.

Durante la incubación, el ADN y algunas sales precipitarán de la solución; en el siguiente paso, este precipitado se recoge por centrifugación en un tubo de microcentrífuga a altas velocidades (~12 000 g ). El tiempo y la velocidad de centrifugación tienen el mayor efecto en las tasas de recuperación de ADN. Nuevamente, los fragmentos más pequeños y las diluciones más altas requieren una centrifugación más larga y rápida. La centrifugación se puede realizar a temperatura ambiente o a 4 °C o 0 °C. Durante la centrifugación, el ADN precipitado tiene que moverse a través de la solución de etanol hasta el fondo del tubo; las temperaturas más bajas aumentan la viscosidad de la solución y los volúmenes más grandes hacen que la distancia sea más larga, por lo que ambos factores reducen la eficiencia de este proceso y requieren una centrifugación más larga para el mismo efecto. ^{[3] [4]} Después de la centrifugación, se elimina la solución sobrenadante, dejando un pellet de ADN crudo. Si el pellet es visible depende de la cantidad de ADN y de su pureza (los pellets más sucios son más fáciles de ver) o del uso de coprecipitantes.

En el siguiente paso, se añade etanol al 70 % al pellet y se mezcla suavemente para desmoldarlo y lavarlo. Esto elimina algunas de las sales presentes en el sobrenadante sobrante y unidas al pellet de ADN, lo que hace que el ADN sea el limpiador final. Esta suspensión se centrifuga nuevamente para volver a sedimentar el ADN y se elimina la solución sobrenadante. Este paso se repite una vez.

Por último, el pellet se seca al aire y el ADN se resuspende en agua u otro tampón deseado . Es importante no secar demasiado el pellet, ya que puede provocar la desnaturalización del ADN y dificultar su resuspensión.

También se puede utilizar isopropanol en lugar de etanol; la eficiencia de precipitación del isopropanol es mayor, por lo que un volumen es suficiente para la precipitación. Sin embargo, el isopropanol es menos volátil que el etanol y necesita más tiempo para secarse al aire en el paso final. El pellet también puede adherirse con menos fuerza al tubo cuando se utiliza isopropanol. ^[2]

• Extracción de ADN
• Extracción con fenol-cloroformo
• Salazón en
• Salazón
• Purificación de ADN mediante SCODA
• Purificación de ácidos nucleicos basada en columnas de centrifugación

• bitesizebio.com Conceptos básicos: cómo funciona la precipitación de ADN y ARN con etanol
• Zeugin JA, Hartley JL (1985). "Precipitación de ADN con etanol" (PDF) . Focus . 7 (4): 1–2 . Consultado el 10 de septiembre de 2008 .
• Crouse J, Amorese D (1987). "Precipitación de etanol: acetato de amonio como alternativa al acetato de sodio" (PDF) . Focus . 9 (2): 3–5. Archivado desde el original (PDF) el 2009-11-22 . Consultado el 2008-09-10 .