Ensayo MTT
Análisis colorimétrico para medir la actividad de las enzimas celulares que reducen un colorante de tetrazolio
Una placa de microtitulación después de un ensayo MTT. El aumento de la cantidad de células provocó un aumento de la coloración púrpura.

El ensayo MTT es un ensayo colorimétrico para evaluar la actividad metabólica celular. [1] [2] Las enzimas oxidorreductasas celulares dependientes de NAD(P)H pueden, en condiciones definidas, reflejar la cantidad de células viables presentes. Estas enzimas son capaces de reducir el colorante de tetrazolio MTT, que es químicamente bromuro de 3-(4,5 - dimetiltiazol - 2-il)-2,5- difeniltetrazolio , a su formazán insoluble, que tiene un color púrpura. Otros colorantes de tetrazolio estrechamente relacionados, incluidos XTT, MTS y los WST, se utilizan junto con el aceptor de electrones intermedio, metosulfato de 1-metoxifenazina (PMS). Con WST-1, que es impermeable a las células, la reducción ocurre fuera de la célula a través del transporte de electrones de la membrana plasmática. [3] Sin embargo, esta explicación tradicionalmente asumida es actualmente discutida ya que también se han encontrado pruebas de reducción de MTT a formazán en estructuras celulares lipídicas sin participación aparente de oxidorreductasas. [4]

Los ensayos con colorante de tetrazolio también se pueden utilizar para medir la citotoxicidad (pérdida de células viables) o la actividad citostática (cambio de proliferación a inactividad) de posibles agentes medicinales y materiales tóxicos. Los ensayos de MTT se realizan generalmente en la oscuridad, ya que el reactivo MTT es sensible a la luz. [5] [6] [7]

El MTT , un tetrazol amarillo , se reduce a formazán púrpura en las células vivas. [8] Se añade una solución de solubilización (normalmente dimetilsulfóxido , una solución de etanol acidificado o una solución del detergente dodecilsulfato de sodio en ácido clorhídrico diluido ) para disolver el producto insoluble de formazán púrpura en una solución coloreada. La absorbancia de esta solución coloreada se puede cuantificar midiendo a una determinada longitud de onda (normalmente entre 500 y 600 nm) con un espectrofotómetro . El grado de absorción de la luz depende del grado de concentración de formazán acumulado dentro de la célula y en la superficie celular. Cuanto mayor sea la concentración de formazán, más profundo será el color púrpura y, por tanto, mayor será la absorbancia.

Se ha propuesto que el XTT (2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolio-5-carboxanilida) reemplace al MTT, lo que produce una mayor sensibilidad y un rango dinámico más alto. El colorante de formazán formado es soluble en agua, lo que evita un paso de solubilización final. [9]

Las sales de tetrazolio solubles en agua son alternativas más recientes al MTT: se desarrollaron introduciendo cargas positivas o negativas y grupos hidroxilo en el anillo de fenilo de la sal de tetrazolio, o mejor con grupos sulfonato añadidos directa o indirectamente al anillo de fenilo.

El MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio), en presencia de metosulfato de fenazina ( PMS ), produce un producto de formazán que tiene una absorbancia máxima a 490 nm en solución salina tamponada con fosfato. El ensayo MTS a menudo se describe como un ensayo MTT "de un solo paso", que ofrece la comodidad de agregar el reactivo directamente al cultivo celular sin los pasos intermitentes requeridos en el ensayo MTT. Sin embargo, esta conveniencia hace que el ensayo MTS sea susceptible a la interferencia colorimétrica ya que los pasos intermitentes en el ensayo MTT eliminan trazas de compuestos coloreados, mientras que estos permanecen en la placa de microtitulación en el ensayo MTS de un solo paso. Se necesitan precauciones para garantizar la precisión al usar este ensayo y existen fuertes argumentos para confirmar los resultados de MTS usando observaciones cualitativas bajo un microscopio. (Esto, sin embargo, es prudente para todos los ensayos colorimétricos). [10]

Las WST (sales de tetrazolio solubles en agua) son una serie de otros colorantes solubles en agua para ensayos de MTT, desarrollados para dar diferentes espectros de absorción de los formazanos formados. [11] La WST-1 y en particular la WST-8 (2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio), son ventajosas sobre la MTT en que se reducen fuera de las células, se combinan con el mediador electrónico PMS y producen un formazán soluble en agua. Finalmente, los ensayos de WST (1) se pueden leer directamente (a diferencia de la MTT que necesita un paso de solubilización), (2) dan una señal más efectiva que la MTT y (3) disminuyen la toxicidad para las células (a diferencia de la MTT permeable a las células y su formazán insoluble que se acumula dentro de las células). [11]

Significado

En general, se supone que la reducción del colorante de tetrazolio depende de las enzimas oxidorreductasas dependientes de NAD(P)H en gran medida en el compartimento citosólico de la célula. [3] [12] Por lo tanto, la reducción de MTT y otros colorantes de tetrazolio depende de la actividad metabólica celular debido al flujo de NAD(P)H. Las células con un metabolismo bajo, como los timocitos y los esplenocitos, reducen muy poco MTT. Por el contrario, las células que se dividen rápidamente muestran altas tasas de reducción de MTT. Es importante tener en cuenta que las condiciones del ensayo pueden alterar la actividad metabólica y, por lo tanto, la reducción del colorante de tetrazolio sin afectar la viabilidad celular. [13] Además, el mecanismo de reducción de los colorantes de tetrazolio, es decir, intracelular (MTT, MTS) frente a extracelular (WST-1), también determinará la cantidad de producto. Además, se ha proporcionado prueba de la reducción espontánea de MTT en compartimentos/estructuras celulares lipídicas, sin catálisis enzimática involucrada. [4] Sin embargo, incluso bajo este paradigma alternativo, el ensayo MTT todavía evalúa el potencial de reducción de una célula (es decir, la disponibilidad de compuestos reductores para impulsar la energética celular). [2] Como tal, la interpretación final de la viabilidad celular permanece sin cambios.

Al estudiar la viabilidad de las células sembradas en andamios fibrosos 3D, el espesor de los andamios puede influir en los resultados del ensayo MTT. [14]

Observación

La densidad óptica (DO) a 550 nm se utiliza para calcular el porcentaje de resultados de viabilidad utilizando la siguiente ecuación: [15]

Viabilidad % = 100 × OD550e / OD550b

dónde:

  • OD550e = Valor medio de la densidad óptica medida del elemento de prueba
  • OD550b = Valor medio de la densidad óptica medida del control negativo

Véase también

Referencias

  1. ^ Gavanji S, Bakhtari A, Famurewa AC, Othman EM (enero de 2023). "Actividad citotóxica de medicamentos a base de hierbas evaluada in vitro: una revisión". Química y biodiversidad . 20 (2): 3–27. doi : 10.1002/cbdv.202201098 . PMID  36595710. S2CID  255473013.
  2. ^ ab Stockert JC, Horobin RW, Colombo LL, Blázquez-Castro A (abril de 2018). "Sales de tetrazolio y productos de formazán en biología celular: evaluación de viabilidad, imágenes de fluorescencia y perspectivas de etiquetado" (PDF) . Acta Histochemica . 120 (3): 159–167. doi :10.1016/j.acthis.2018.02.005. PMID  29496266. Archivado (PDF) desde el original el 24 de febrero de 2022 . Consultado el 15 de abril de 2020 .
  3. ^ ab Berridge MV, Herst PM, Tan AS (2005). "Los colorantes de tetrazolio como herramientas en biología celular: nuevos conocimientos sobre su reducción celular". Biotechnology Annual Review . 11 : 127–152. doi :10.1016/S1387-2656(05)11004-7. ISBN 9780444519528. Número de identificación personal  16216776.
  4. ^ ab Stockert JC, Blázquez-Castro A, Cañete M, Horobin RW, Villanueva A (diciembre de 2012). "Ensayo MTT para viabilidad celular: la localización intracelular del producto formazán se encuentra en gotas de lípidos". Acta Histochemica . 114 (8): 785–796. doi :10.1016/j.acthis.2012.01.006. PMID  22341561.
  5. ^ Sharma, Dr Rudra (5 de octubre de 2022). "Prueba de citotoxicidad mediante ensayo MTT: procedimiento, análisis y resultados - Soluciones de investigación ACME" . Consultado el 6 de octubre de 2022 .
  6. ^ Müller, G.; Kramer, A. (2006). "Estudio comparativo de la citotoxicidad in vitro de la povidona yodada en solución, en ungüento o en una formulación liposomal (Repithel<sup>®</sup>) y de antisépticos seleccionados". Dermatología . 212 (Supl. 1): 91–93. doi :10.1159/000090102. ISSN  1018-8665. PMID  16490982. S2CID  818013.
  7. ^ Pintor, AVB; Queiroz, LD; Barcelos, R.; Primo, LSG; Maia, LC; Alves, GG (27 de julio de 2020). "MTT versus otros ensayos de viabilidad celular para evaluar la biocompatibilidad de los materiales de relleno del conducto radicular: una revisión sistemática". Revista Internacional de Endodoncia . 53 (10): 1348–1373. doi : 10.1111/iej.13353 . ISSN  0143-2885. PMID  32602945. S2CID  220271896.
  8. ^ Mosmann T (diciembre de 1983). "Ensayo colorimétrico rápido para el crecimiento y la supervivencia celular: aplicación a ensayos de proliferación y citotoxicidad". Journal of Immunological Methods . 65 (1–2): 55–63. doi :10.1016/0022-1759(83)90303-4. PMID  6606682.
  9. ^ "¿Por qué debería usar XTT en lugar de MTT?" (PDF, 0,1 MB) . [aniara.com] . ANIARA. Archivado (PDF) desde el original el 2018-04-06 . Consultado el 2010-11-19 .
  10. ^ Cory AH, Owen TC, Barltrop JA, Cory JG (julio de 1991). "Uso de un ensayo de tetrazolio/formazán soluble en agua para ensayos de crecimiento celular en cultivo". Cancer Communications . 3 (7): 207–212. doi :10.3727/095535491820873191. PMID  1867954.
  11. ^ ab "Sales de tetrazolio solubles en agua (WST)" (PDF, 0,4 MB) . [interchim.com] . Interchim . Archivado (PDF) desde el original el 22 de diciembre de 2018 . Consultado el 12 de agosto de 2013 .
  12. ^ Berridge MV, Tan AS (junio de 1993). "Caracterización de la reducción celular del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT): localización subcelular, dependencia del sustrato y participación del transporte electrónico mitocondrial en la reducción del MTT". Archivos de bioquímica y biofísica . 303 (2): 474–482. doi :10.1006/abbi.1993.1311. PMID  8390225.
  13. ^ Ghasemi M, Turnbull T, Sebastian S, Kempson I (noviembre de 2021). "El ensayo MTT: utilidad, limitaciones, dificultades e interpretación en el análisis de células individuales y en masa". Revista internacional de ciencias moleculares . 22 (23): 12827. doi : 10.3390/ijms222312827 . PMC 8657538 . PMID  34884632. 
  14. ^ Lyundup AV, Demchenko AG, Tenchurin TH, Krasheninnikov ME, Klabukov ID, Shepelev AD (2016). "Mejora de la eficacia de siembra de cultivos de células epiteliales y estromales en matrices biodegradables mediante cultivo dinámico". Genes to Cells . 11 (3): 102–107. doi :10.5281/zenodo.1175840. ISSN  2313-1829.
  15. ^ "ISO 10993-5:2009". ISO . Consultado el 6 de octubre de 2022 .

Lectura adicional

  • Wilson AP (2000). "Capítulo 7: Citotoxicidad y viabilidad". En Masters JR (ed.). Cultivo de células animales: un enfoque práctico. Vol. 1 (3.ª ed.). Oxford: Oxford University Press . ISBN 978-0-19-963796-6. LCCN  00026267. OCLC  43555390. Archivado desde el original el 14 de abril de 2020. Consultado el 24 de septiembre de 2016 .
  • Bernas T, Dobrucki J (abril de 2002). "Reducción mitocondrial y no mitocondrial de MTT: interacción de MTT con sondas fluorescentes mitocondriales TMRE, JC-1 y NAO". Citometría . 47 (4): 236–242. doi : 10.1002/cyto.10080 . PMID  11933013.
  • Protocolo de ensayo MTT
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