Microscopio óptico

El microscopio óptico , también conocido como microscopio óptico , es un tipo de microscopio que utiliza comúnmente luz visible y un sistema de lentes para generar imágenes ampliadas de objetos pequeños. Los microscopios ópticos son el diseño más antiguo de microscopio y posiblemente se inventaron en su forma compuesta actual en el siglo XVII. Los microscopios ópticos básicos pueden ser muy simples, aunque muchos diseños complejos tienen como objetivo mejorar la resolución y el contraste de la muestra . ^{[ cita requerida ]}

El objeto se coloca sobre una platina y se puede observar directamente a través de uno o dos oculares del microscopio. En los microscopios de alta potencia, ambos oculares suelen mostrar la misma imagen, pero con un microscopio estereoscópico se utilizan imágenes ligeramente diferentes para crear un efecto 3D. Normalmente se utiliza una cámara para capturar la imagen ( micrografía ). ^{[ cita requerida ]}

La muestra se puede iluminar de diversas maneras. Los objetos transparentes se pueden iluminar desde abajo y los objetos sólidos se pueden iluminar con luz que entra a través ( campo claro ) o alrededor ( campo oscuro ) de la lente del objetivo. La luz polarizada se puede utilizar para determinar la orientación del cristal de los objetos metálicos. La imagen por contraste de fases se puede utilizar para aumentar el contraste de la imagen resaltando pequeños detalles con diferente índice de refracción. ^{[ cita requerida ]}

Por lo general, se proporciona una variedad de lentes objetivos con diferentes aumentos montados en una torreta, lo que permite girarlos para colocarlos en su lugar y brindar la posibilidad de hacer zoom. El poder de aumento máximo de los microscopios ópticos generalmente está limitado a alrededor de 1000x debido al poder de resolución limitado de la luz visible. Si bien es posible realizar aumentos mayores, no se resuelven detalles adicionales del objeto. ^{[ cita requerida ]}

Las alternativas a la microscopía óptica que no utilizan luz visible incluyen la microscopía electrónica de barrido , la microscopía electrónica de transmisión y la microscopía de sonda de barrido y, como resultado, pueden lograr aumentos mucho mayores.

Existen dos tipos básicos de microscopios ópticos: microscopios simples y microscopios compuestos. Un microscopio simple utiliza la potencia óptica de una sola lente o grupo de lentes para la ampliación. Un microscopio compuesto utiliza un sistema de lentes (un conjunto amplía la imagen producida por otro) para lograr una ampliación mucho mayor de un objeto. La gran mayoría de los microscopios de investigación modernos son microscopios compuestos, mientras que algunos microscopios digitales comerciales más económicos son microscopios simples de una sola lente. Los microscopios compuestos se pueden dividir a su vez en una variedad de otros tipos de microscopios, que difieren en sus configuraciones ópticas, costo y propósitos previstos. ^{[ cita requerida ]}

Un microscopio simple utiliza una lente o un conjunto de lentes para agrandar un objeto solo mediante un aumento angular, lo que le da al espectador una imagen virtual ampliada y erecta . ^{[1] [2]} El uso de una sola lente convexa o grupos de lentes se encuentra en dispositivos de aumento simples como la lupa , las lupas y los oculares para telescopios y microscopios.

Un microscopio compuesto utiliza una lente cercana al objeto que se observa para recolectar luz (llamada lente objetivo ), que enfoca una imagen real del objeto dentro del microscopio (imagen 1). Esa imagen luego se amplía mediante una segunda lente o grupo de lentes (llamado ocular ) que le da al observador una imagen virtual invertida y agrandada del objeto (imagen 2). ^[3] El uso de una combinación de objetivo/ocular compuesto permite un aumento mucho mayor. Los microscopios compuestos comunes a menudo cuentan con lentes objetivos intercambiables, lo que permite al usuario ajustar rápidamente el aumento. ^[3] Un microscopio compuesto también permite configuraciones de iluminación más avanzadas, como el contraste de fase .

Existen muchas variantes del diseño del microscopio óptico compuesto para fines especializados. Algunas de ellas son diferencias de diseño físico que permiten la especialización para determinados fines:

• Microscopio estereoscópico , un microscopio de baja potencia que proporciona una vista estereoscópica de la muestra, comúnmente utilizado para disección.
• El microscopio de comparación tiene dos trayectorias de luz separadas que permiten la comparación directa de dos muestras a través de una imagen en cada ojo.
• Microscopio invertido , para estudiar muestras desde abajo; útil para cultivos celulares en líquido o para metalografía.
• Microscopio de inspección de conectores de fibra óptica, diseñado para la inspección de los extremos de los conectores.
• Microscopio viajero , para estudio de muestras de alta resolución óptica .

Otras variantes del microscopio están diseñadas para diferentes técnicas de iluminación:

• Microscopio petrográfico , cuyo diseño suele incluir un filtro polarizador, una platina giratoria y una placa de yeso para facilitar el estudio de minerales u otros materiales cristalinos cuyas propiedades ópticas pueden variar con la orientación.
• Microscopio polarizador , similar al microscopio petrográfico.
• Microscopio de contraste de fases , que aplica el método de iluminación de contraste de fases.
• Microscopio de epifluorescencia , diseñado para el análisis de muestras que incluyan fluoróforos.
• Microscopio confocal , una variante ampliamente utilizada de iluminación epifluorescente que utiliza un láser de escaneo para iluminar una muestra para fluorescencia.
• Microscopio de dos fotones , utilizado para obtener imágenes de fluorescencia a mayor profundidad en medios de dispersión y reducir el fotoblanqueo, especialmente en muestras vivas.
• Microscopio para estudiantes: un microscopio a menudo de baja potencia, con controles simplificados y a veces con ópticas de baja calidad, diseñado para uso escolar o como instrumento de iniciación para niños. ^[4]
• Ultramicroscopio , un microscopio óptico adaptado que utiliza la dispersión de la luz para permitir la observación de partículas diminutas cuyo diámetro es inferior o cercano a la longitud de onda de la luz visible (alrededor de 500 nanómetros); en su mayor parte obsoleto desde la llegada de los microscopios electrónicos.
• El microscopio Raman mejorado con punta es una variante del microscopio óptico basado en la espectroscopia Raman mejorada con punta , sin los límites de resolución tradicionales basados ​​en la longitud de onda. ^{[5] [6]} Este microscopio se realiza principalmente en plataformas de microscopio de sonda de barrido utilizando todas las herramientas ópticas.

Un microscopio digital es un microscopio equipado con una cámara digital que permite la observación de una muestra a través de un ordenador . Los microscopios también pueden estar controlados total o parcialmente por ordenador con distintos niveles de automatización. La microscopía digital permite un mayor análisis de una imagen microscópica, por ejemplo, mediciones de distancias y áreas y cuantificación de una tinción fluorescente o histológica .

También se encuentran disponibles comercialmente microscopios digitales de baja potencia, microscopios USB . Se trata básicamente de cámaras web con una lente macro de alta potencia y, por lo general, no utilizan transiluminación . La cámara se conecta directamente al puerto USB de un ordenador para mostrar las imágenes directamente en el monitor. Ofrecen aumentos modestos (hasta unos 200×) sin necesidad de utilizar oculares y a un coste muy bajo. La iluminación de alta potencia suele proporcionarla una o varias fuentes LED adyacentes a la lente de la cámara.

La microscopía digital con niveles de luz muy bajos para evitar dañar las muestras biológicas vulnerables está disponible utilizando cámaras digitales sensibles de conteo de fotones . Se ha demostrado que una fuente de luz que proporcione pares de fotones entrelazados puede minimizar el riesgo de daño a las muestras más sensibles a la luz. En esta aplicación de imágenes fantasma a la microscopía de fotones dispersos, la muestra se ilumina con fotones infrarrojos, cada uno de ellos correlacionado espacialmente con un compañero entrelazado en la banda visible para obtener imágenes eficientes mediante una cámara de conteo de fotones. ^[7]

Los primeros microscopios eran lupas de una sola lente con aumento limitado, que datan al menos del uso generalizado de lentes en anteojos en el siglo XIII. ^[8]

Los microscopios compuestos aparecieron por primera vez en Europa alrededor de 1620 ^{[9] [10],} incluido uno demostrado por Cornelis Drebbel en Londres (alrededor de 1621) y otro exhibido en Roma en 1624. ^{[11] [12]}

Se desconoce quién fue el verdadero inventor del microscopio compuesto, aunque a lo largo de los años se han hecho muchas afirmaciones. Entre ellas, una afirmación hecha 35 ^[13] años después de su aparición por el fabricante de gafas holandés Johannes Zachariassen de que su padre, Zacharias Janssen , inventó el microscopio compuesto y/o el telescopio ya en 1590. El testimonio de Johannes, que algunos consideran dudoso, ^{[14] [15] [16]} retrasa tanto la fecha de la invención que Zacharias habría sido un niño en ese momento, lo que lleva a la especulación de que, para que la afirmación de Johannes fuera cierta, el microscopio compuesto tendría que haber sido inventado por el abuelo de Johannes, Hans Martens. ^[17] Otra afirmación es que el competidor de Janssen, Hans Lippershey (que solicitó la primera patente del telescopio en 1608) también inventó el microscopio compuesto. ^[18] Otros historiadores apuntan al innovador holandés Cornelis Drebbel con su microscopio compuesto de 1621. ^{[11] [12]}

Galileo Galilei es citado a veces como inventor del microscopio compuesto. Después de 1610, descubrió que podía enfocar de cerca su telescopio para ver objetos pequeños, como moscas, de cerca ^[19] y/o podía mirar a través del extremo equivocado al revés para ampliar objetos pequeños. ^[20] El único inconveniente era que su telescopio de 2 pies de largo tenía que extenderse hasta 6 pies para ver objetos tan cercanos. ^[21] Después de ver el microscopio compuesto construido por Drebbel exhibido en Roma en 1624, Galileo construyó su propia versión mejorada. ^{[11] [12]} En 1625, Giovanni Faber acuñó el nombre de microscopio para el microscopio compuesto que Galileo presentó a la Accademia dei Lincei en 1624 ^[22] (Galileo lo había llamado el " occhiolino " u " pequeño ojo "). Faber acuñó el nombre a partir de las palabras griegas μικρόν (micrón), que significa "pequeño", y σκοπεῖν (skopein), que significa "mirar", un nombre que se supone que es análogo a "telescopio", otra palabra acuñada por los linceanos. ^[23]

Christiaan Huygens , otro holandés, desarrolló un sistema ocular simple de dos lentes a finales del siglo XVII que estaba corregido acromáticamente , lo que supuso un gran avance en el desarrollo de microscopios. El ocular Huygens todavía se fabrica hoy en día, pero tiene un tamaño de campo pequeño y otras desventajas menores.

Se le atribuye a Antonie van Leeuwenhoek (1632-1724) haber llamado la atención de los biólogos sobre el microscopio, a pesar de que ya se producían lentes de aumento simples en el siglo XVI. Los microscopios caseros de van Leeuwenhoek eran microscopios simples, con una sola lente muy pequeña, pero fuerte. Eran difíciles de usar, pero le permitieron a van Leeuwenhoek ver imágenes detalladas. Se necesitaron alrededor de 150 años de desarrollo óptico antes de que el microscopio compuesto pudiera proporcionar la misma calidad de imagen que los microscopios simples de van Leeuwenhoek, debido a las dificultades para configurar múltiples lentes. En la década de 1850, John Leonard Riddell , profesor de química en la Universidad de Tulane , inventó el primer microscopio binocular práctico mientras realizaba una de las primeras y más extensas investigaciones microscópicas estadounidenses sobre el cólera . ^{[25] [26]}

Si bien la tecnología básica de microscopios y la óptica han estado disponibles durante más de 400 años, fue mucho más recientemente que se desarrollaron técnicas de iluminación de muestras para generar las imágenes de alta calidad que vemos hoy. ^{[ cita requerida ]}

En agosto de 1893, August Köhler desarrolló la iluminación Köhler . Este método de iluminación de muestras da lugar a una iluminación extremadamente uniforme y supera muchas limitaciones de las técnicas de iluminación de muestras más antiguas. Antes del desarrollo de la iluminación Köhler, la imagen de la fuente de luz, por ejemplo, el filamento de una bombilla , siempre era visible en la imagen de la muestra. ^{[ cita requerida ]}

El Premio Nobel de Física fue otorgado en 1953 al físico holandés Frits Zernike por su desarrollo de la iluminación de contraste de fases , que permite obtener imágenes de muestras transparentes. Al utilizar interferencias en lugar de absorción de luz, se pueden obtener imágenes de muestras extremadamente transparentes, como células vivas de mamíferos , sin tener que utilizar técnicas de tinción. Tan solo dos años después, en 1955, Georges Nomarski publicó la teoría de la microscopía de contraste de interferencia diferencial , otra técnica de obtención de imágenes basada en interferencias . ^{[ cita requerida ]}

La microscopía biológica moderna depende en gran medida del desarrollo de sondas fluorescentes para estructuras específicas dentro de una célula. A diferencia de la microscopía óptica transiluminada normal, en la microscopía de fluorescencia la muestra se ilumina a través de la lente del objetivo con un conjunto estrecho de longitudes de onda de luz. Esta luz interactúa con los fluoróforos de la muestra, que luego emiten luz de una longitud de onda más larga . Es esta luz emitida la que forma la imagen.

Desde mediados del siglo XX, se han utilizado tinciones fluorescentes químicas, como DAPI , que se une al ADN , para marcar estructuras específicas dentro de la célula. Los desarrollos más recientes incluyen la inmunofluorescencia , que utiliza anticuerpos marcados con fluorescencia para reconocer proteínas específicas dentro de una muestra, y proteínas fluorescentes como GFP , que una célula viva puede expresar y convertirla en fluorescente.

Todos los microscopios ópticos modernos diseñados para observar muestras mediante luz transmitida comparten los mismos componentes básicos de la trayectoria de la luz. Además, la gran mayoría de los microscopios tienen los mismos componentes "estructurales" ^[27] (numerados a continuación según la imagen de la derecha):

• Ocular (lente ocular) (1)
• Torreta de objetivo, revólver o pieza nasal giratoria (para sujetar múltiples lentes de objetivo) (2)
• Lentes objetivos (3)
• Perillas de enfoque (para mover el escenario)
  • Ajuste grueso (4)
  • Ajuste fino (5)
• Platina (para sujetar la muestra) (6)
• Fuente de luz (una luz o un espejo ) (7)
• Diafragma y condensador (8)
• Escenario mecánico (9)

El ocular , o lente ocular, es un cilindro que contiene dos o más lentes; su función es enfocar la imagen para el ojo. El ocular se inserta en el extremo superior del tubo del cuerpo. Los oculares son intercambiables y se pueden insertar muchos oculares diferentes con diferentes grados de aumento. Los valores de aumento típicos para los oculares incluyen 5×, 10× (el más común), 15× y 20×. En algunos microscopios de alto rendimiento, la configuración óptica del objetivo y el ocular se combinan para brindar el mejor rendimiento óptico posible. Esto ocurre más comúnmente con los objetivos apocromáticos .

La torreta de objetivos, revólver o pieza de morro giratorio es la pieza que sostiene el conjunto de lentes de objetivo. Permite al usuario cambiar entre lentes de objetivo.

En el extremo inferior de un microscopio óptico compuesto típico, hay una o más lentes objetivas que recogen la luz de la muestra. El objetivo suele estar en una carcasa cilíndrica que contiene una lente compuesta de vidrio de un solo elemento o de varios elementos. Normalmente, habrá alrededor de tres lentes objetivas atornilladas en una pieza nasal circular que se puede girar para seleccionar la lente objetiva requerida. Estas disposiciones están diseñadas para ser parfocales , lo que significa que cuando uno cambia de una lente a otra en un microscopio, la muestra permanece enfocada . Los objetivos de microscopio se caracterizan por dos parámetros, a saber, aumento y apertura numérica . El primero suele oscilar entre 5× y 100×, mientras que el segundo oscila entre 0,14 y 0,7, lo que corresponde a longitudes focales de aproximadamente 40 a 2 mm, respectivamente. Las lentes objetivas con mayores aumentos normalmente tienen una apertura numérica mayor y una profundidad de campo menor en la imagen resultante. Algunas lentes objetivas de alto rendimiento pueden requerir oculares combinados para ofrecer el mejor rendimiento óptico.

Algunos microscopios utilizan objetivos de inmersión en aceite o en agua para lograr una mayor resolución con un aumento elevado. Estos se utilizan con un material que coincida con el índice, como aceite de inmersión o agua, y un cubreobjetos coincidente entre la lente del objetivo y la muestra. El índice de refracción del material que coincide con el índice es mayor que el del aire, lo que permite que la lente del objetivo tenga una apertura numérica mayor (superior a 1) de modo que la luz se transmita desde la muestra hasta la cara exterior de la lente del objetivo con una refracción mínima. Se pueden lograr aperturas numéricas de hasta 1,6. ^[28] La apertura numérica mayor permite la recolección de más luz, lo que hace posible la observación detallada de detalles más pequeños. Una lente de inmersión en aceite suele tener un aumento de 40 a 100×.

Las perillas de ajuste mueven la platina hacia arriba y hacia abajo con ajustes separados para el enfoque grueso y fino. Los mismos controles permiten que el microscopio se ajuste a muestras de diferentes espesores. En los diseños más antiguos de microscopios, las ruedas de ajuste del enfoque mueven el tubo del microscopio hacia arriba o hacia abajo en relación con el soporte y tenían una platina fija.

El conjunto óptico se fija tradicionalmente a un brazo rígido, que a su vez está fijado a un robusto pie en forma de U para proporcionar la rigidez necesaria. El ángulo del brazo puede ser ajustable para permitir ajustar el ángulo de visión.

El marco proporciona un punto de montaje para varios controles del microscopio. Normalmente, esto incluirá controles para enfocar, típicamente una rueda moleteada grande para ajustar el enfoque grueso, junto con una rueda moleteada más pequeña para controlar el enfoque fino. Otras características pueden ser controles de lámpara y/o controles para ajustar el condensador.

La platina es una plataforma situada debajo de la lente del objetivo que sostiene la muestra que se está observando. En el centro de la platina hay un orificio por el que pasa la luz para iluminar la muestra. La platina suele tener brazos para sujetar portaobjetos (placas de vidrio rectangulares con dimensiones típicas de 25 × 75 mm, sobre las que se monta la muestra).

Con aumentos superiores a 100×, no es práctico mover un portaobjetos con la mano. Una platina mecánica, típica de los microscopios de precio medio y alto, permite realizar pequeños movimientos del portaobjetos mediante perillas de control que reposicionan la muestra o el portaobjetos según se desee. Si un microscopio no tenía originalmente una platina mecánica, es posible que se le pueda agregar una.

Todas las platinas se mueven hacia arriba y hacia abajo para enfocar. Con una platina mecánica, las correderas se mueven sobre dos ejes horizontales para posicionar la muestra y examinar sus detalles.

El enfoque comienza con un aumento menor para que el usuario pueda centrar la muestra en la platina. Para pasar a un aumento mayor, es necesario mover la platina más arriba en sentido vertical para volver a enfocar con el aumento mayor y también puede requerir un ligero ajuste de la posición horizontal de la muestra. Los ajustes de la posición horizontal de la muestra son la razón por la que se utiliza una platina mecánica.

Debido a la dificultad de preparar las muestras y montarlas en portaobjetos, para los niños es mejor comenzar con portaobjetos preparados que estén centrados y se enfoquen fácilmente independientemente del nivel de enfoque utilizado.

Se pueden utilizar muchas fuentes de luz. En su forma más sencilla, la luz del día se dirige a través de un espejo . Sin embargo, la mayoría de los microscopios tienen su propia fuente de luz ajustable y controlable, a menudo una lámpara halógena , aunque la iluminación mediante LED y láseres se está volviendo una opción cada vez más común. La iluminación Köhler se suele proporcionar en instrumentos más caros.

El condensador es una lente diseñada para enfocar la luz de la fuente de iluminación sobre la muestra. El condensador también puede incluir otras características, como un diafragma y/o filtros, para controlar la calidad e intensidad de la iluminación. Para técnicas de iluminación como la microscopía de campo oscuro , contraste de fase y contraste de interferencia diferencial, los componentes ópticos adicionales deben estar alineados con precisión en la trayectoria de la luz.

La potencia o aumento real de un microscopio óptico compuesto es el producto de las potencias del ocular y del objetivo. Por ejemplo, un aumento de 10x en el ocular y un aumento de 100x en el objetivo dan como resultado un aumento total de 1000x. Los entornos modificados, como el uso de aceite o luz ultravioleta, pueden aumentar la resolución y permitir obtener detalles con aumentos superiores a 1000x.

Existen muchas técnicas que modifican la trayectoria de la luz para generar una imagen con un contraste mejorado a partir de una muestra. Las principales técnicas para generar un mayor contraste a partir de la muestra incluyen la luz polarizada cruzada , el campo oscuro , el contraste de fase y la iluminación de contraste de interferencia diferencial . Una técnica reciente ( Sarfus ) combina la luz polarizada cruzada y portaobjetos específicos con contraste mejorado para la visualización de muestras nanométricas.

• Cuatro ejemplos de técnicas de transiluminación utilizadas para generar contraste en una muestra de papel tisú . 1,559 μm/píxel.
• 
  Iluminación de campo brillante , el contraste de la muestra proviene de la absorbancia de la luz en la muestra.
• 
  Iluminación con luz polarizada cruzada , el contraste de la muestra proviene de la rotación de la luz polarizada a través de la muestra.
• 
  Iluminación de campo oscuro , el contraste de la muestra proviene de la luz dispersada por la muestra.
• 
  Iluminación de contraste de fase , el contraste de la muestra proviene de la interferencia de diferentes longitudes de trayectoria de la luz a través de la muestra.

Los microscopios modernos permiten algo más que observar imágenes de una muestra mediante luz transmitida; existen muchas técnicas que se pueden utilizar para extraer otros tipos de datos. La mayoría de ellas requieren equipos adicionales además de un microscopio compuesto básico.

• Luz reflejada o iluminación incidente (para análisis de estructuras superficiales)
• Microscopía de fluorescencia, ambas:

• Microscopía de epifluorescencia
• Microscopía confocal

• Microespectroscopia (donde se integra un espectrofotómetro UV-visible con un microscopio óptico)
• Microscopía ultravioleta
• Microscopía de infrarrojo cercano
• Microscopía de transmisión múltiple ^[29] para mejora del contraste y reducción de la aberración.
• Automatización (para escaneo automático de una muestra grande o captura de imágenes)

La microscopía óptica se utiliza ampliamente en microelectrónica, nanofísica, biotecnología, investigación farmacéutica, mineralogía y microbiología. ^[30]

La microscopía óptica se utiliza para el diagnóstico médico ; el campo se denomina histopatología cuando se trata de tejidos o en pruebas de frotis en células libres o fragmentos de tejido.

En el uso industrial, los microscopios binoculares son comunes. Aparte de las aplicaciones que requieren una verdadera percepción de profundidad , el uso de oculares dobles reduce la fatiga visual asociada con las largas jornadas de trabajo en una estación de microscopía. En ciertas aplicaciones, los microscopios de larga distancia de trabajo o de foco largo ^[31] son ​​beneficiosos. Puede ser necesario examinar un objeto detrás de una ventana o los objetos industriales pueden ser un peligro para el objetivo. Estas ópticas se parecen a los telescopios con capacidades de enfoque cercano. ^{[32] [33]}

Los microscopios de medición se utilizan para realizar mediciones de precisión. Hay dos tipos básicos. Uno tiene una retícula graduada para permitir medir distancias en el plano focal. ^[34] El otro tipo (más antiguo) tiene una cruz simple y un mecanismo micrométrico para mover el objeto en relación con el microscopio. ^[35]

Los microscopios portátiles muy pequeños han encontrado cierta utilidad en lugares donde un microscopio de laboratorio sería una carga. ^[36]

A aumentos muy altos con luz transmitida, los objetos puntuales se ven como discos difusos rodeados de anillos de difracción . Estos se denominan discos de Airy . El poder de resolución de un microscopio se toma como la capacidad de distinguir entre dos discos de Airy muy espaciados (o, en otras palabras, la capacidad del microscopio de revelar detalles estructurales adyacentes como distintos y separados). Son estos impactos de la difracción los que limitan la capacidad de resolver detalles finos. La extensión y magnitud de los patrones de difracción se ven afectados tanto por la longitud de onda de la luz (λ), los materiales refractivos utilizados para fabricar la lente del objetivo y la apertura numérica (NA) de la lente del objetivo. Por lo tanto, existe un límite finito más allá del cual es imposible resolver puntos separados en el campo objetivo, conocido como el límite de difracción . Suponiendo que las aberraciones ópticas en toda la configuración óptica son despreciables, la resolución d , puede expresarse como:

${\displaystyle d={\frac {\lambda }{2NA}}}$

Generalmente se asume una longitud de onda de 550 nm, que corresponde a la luz verde . Con aire como medio externo, la NA más alta práctica es 0,95, y con aceite, hasta 1,5. En la práctica, el valor más bajo de d que se puede obtener con lentes convencionales es de aproximadamente 200 nm. Un nuevo tipo de lente que utiliza dispersión múltiple de la luz permitió mejorar la resolución por debajo de los 100 nm. ^[37]

Existen múltiples técnicas para alcanzar resoluciones superiores al límite de luz transmitida descrito anteriormente. Las técnicas holográficas, como las descritas por Courjon y Bulabois en 1979, también son capaces de superar este límite de resolución, aunque la resolución fue restringida en su análisis experimental. ^[38]

Existen más técnicas disponibles para el uso de muestras fluorescentes. Algunos ejemplos son Vertico SMI , la microscopía óptica de barrido de campo cercano que utiliza ondas evanescentes y la depleción de emisión estimulada . En 2005, se describió un microscopio capaz de detectar una sola molécula como herramienta de enseñanza. ^[39]

A pesar de los importantes avances logrados en la última década, las técnicas para superar el límite de difracción siguen siendo limitadas y especializadas.

Aunque la mayoría de las técnicas se centran en aumentar la resolución lateral, también hay algunas técnicas que tienen como objetivo permitir el análisis de muestras extremadamente delgadas. Por ejemplo, los métodos Sarfus colocan la muestra delgada sobre una superficie que mejora el contraste y, de ese modo, permiten visualizar directamente películas de hasta 0,3 nanómetros de espesor.

El 8 de octubre de 2014, el Premio Nobel de Química fue otorgado a Eric Betzig , William Moerner y Stefan Hell por el desarrollo de la microscopía de fluorescencia de súper resolución . ^{[40] [41]}

La microscopía de iluminación modulada espacialmente (SMI, por sus siglas en inglés) es un proceso óptico de luz de la denominada ingeniería de función de dispersión de puntos (PSF, por sus siglas en inglés). Se trata de procesos que modifican la PSF de un microscopio de manera adecuada para aumentar la resolución óptica, maximizar la precisión de las mediciones de distancia de objetos fluorescentes que son pequeños en relación con la longitud de onda de la luz que los ilumina o extraer otros parámetros estructurales en el rango nanométrico. ^{[42] [43]}

SPDM (microscopía de distancia de precisión espectral), la tecnología básica de microscopía de localización, es un proceso óptico de luz de microscopía de fluorescencia que permite mediciones de posición, distancia y ángulo en partículas "ópticamente aisladas" (por ejemplo, moléculas) muy por debajo del límite teórico de resolución para la microscopía óptica. "Ópticamente aislada" significa que en un momento dado, solo se registra una única partícula/molécula dentro de una región de un tamaño determinado por la resolución óptica convencional (normalmente aprox. 200–250 nm de diámetro ). Esto es posible cuando las moléculas dentro de dicha región llevan todas diferentes marcadores espectrales (por ejemplo, diferentes colores u otras diferencias utilizables en la emisión de luz de diferentes partículas). ^{[44] [45] [46] [47]}

Muchos colorantes fluorescentes estándar como GFP , colorantes Alexa, colorantes Atto, Cy2/Cy3 y moléculas de fluoresceína se pueden utilizar para la microscopía de localización, siempre que se den ciertas condiciones fotofísicas. Con esta tecnología denominada SPDMphymod (fluoróforos físicamente modificables), una única longitud de onda láser de intensidad adecuada es suficiente para la obtención de imágenes nanométricas. ^[48]

La microscopía de súper resolución 3D con colorantes fluorescentes estándar se puede lograr mediante la combinación de microscopía de localización para colorantes fluorescentes estándar SPDMphymod e iluminación estructurada SMI. ^[49]

La depleción de emisión estimulada es un ejemplo sencillo de cómo es posible lograr una resolución superior al límite de difracción, pero tiene importantes limitaciones. STED es una técnica de microscopía de fluorescencia que utiliza una combinación de pulsos de luz para inducir la fluorescencia en una pequeña subpoblación de moléculas fluorescentes en una muestra. Cada molécula produce un punto de luz limitado por la difracción en la imagen, y el centro de cada uno de estos puntos corresponde a la ubicación de la molécula. Como el número de moléculas fluorescentes es bajo, es poco probable que los puntos de luz se superpongan y, por lo tanto, se pueden colocar con precisión. Luego, este proceso se repite muchas veces para generar la imagen. Stefan Hell , del Instituto Max Planck de Química Biofísica, recibió el décimo Premio Alemán del Futuro en 2006 y el Premio Nobel de Química en 2014 por su desarrollo del microscopio STED y las metodologías asociadas. ^[50]

Para superar las limitaciones impuestas por el límite de difracción de la luz visible se han diseñado otros microscopios que utilizan otras ondas.

• Microscopio de fuerza atómica (AFM)
• Microscopio electrónico de barrido (SEM)
• Microscopía de conductancia iónica de barrido (SICM)
• Microscopio de efecto túnel de barrido (STM)
• Microscopía electrónica de transmisión (MET)
• Microscopio ultravioleta
• Microscopio de rayos X

Es importante señalar que las ondas de frecuencia más alta tienen una interacción limitada con la materia; por ejemplo, los tejidos blandos son relativamente transparentes a los rayos X, lo que da lugar a distintas fuentes de contraste y diferentes aplicaciones objetivo.

El uso de electrones y rayos X en lugar de luz permite una resolución mucho mayor: la longitud de onda de la radiación es más corta, por lo que el límite de difracción es menor. Para que la sonda de longitud de onda corta no sea destructiva, se ha propuesto el sistema de imágenes de haz atómico ( nanoscopio atómico ) y se ha discutido ampliamente en la literatura, pero aún no es competitivo con los sistemas de imágenes convencionales.

El STM y el AFM son técnicas de sonda de barrido que utilizan una sonda pequeña que se desliza sobre la superficie de la muestra. La resolución en estos casos está limitada por el tamaño de la sonda; las técnicas de micromaquinado pueden producir sondas con radios de punta de 5 a 10 nm.

Además, métodos como la microscopía electrónica o de rayos X utilizan vacío o vacío parcial, lo que limita su uso para muestras vivas y biológicas (con la excepción de un microscopio electrónico de barrido ambiental ). Las cámaras de muestras necesarias para todos estos instrumentos también limitan el tamaño de la muestra, y la manipulación de la misma es más difícil. El color no se puede ver en las imágenes realizadas con estos métodos, por lo que se pierde cierta información. Sin embargo, son esenciales cuando se investigan efectos moleculares o atómicos, como el endurecimiento por envejecimiento en aleaciones de aluminio o la microestructura de polímeros .

• Van Helden, Albert; Dupré, Sven; Van Gent, Rob (2011). Los orígenes del telescopio . Prensa de la Universidad de Ámsterdam. ISBN 978-9069846156.

• "Preparación de muestras metalográficas y materialográficas, microscopía óptica, análisis de imágenes y pruebas de dureza", Kay Geels en colaboración con Struers A/S, ASTM International 2006.
• "Microscopía óptica: una revolución contemporánea en curso", Siegfried Weisenburger y Vahid Sandoghdar, arXiv:1412.3255 2014.

• Microscopios antiguos e instrumentos científicos Un sitio sobre microscopios antiguos, sus accesorios e historia
• Antique Microscopes.com Una colección de microscopios antiguos
• Microscopios históricos, una colección ilustrada con más de 3000 fotografías de microscopios científicos de fabricantes europeos (en alemán)
• La Colección Golub, una colección de microscopios de los siglos XVII al XIX, que incluye descripciones detalladas
• Expresiones moleculares, conceptos en microscopía óptica
• Tutorial en línea de microscopía óptica práctica en la Universidad de Cambridge
• OpenWetWare
• Base de datos centrada en células