Microscopía electrónica inmunitaria

La microscopía inmunoelectrónica (más a menudo llamada microscopía inmunoelectrónica ) es el equivalente de la inmunofluorescencia , pero utiliza la microscopía electrónica en lugar de la microscopía óptica . ^[1] La microscopía inmunoelectrónica identifica y localiza una molécula de interés, específicamente una proteína de interés, uniéndola a un anticuerpo particular . Este enlace puede formarse antes o después de incrustar las células en portaobjetos. Se produce una reacción entre el antígeno y el anticuerpo, lo que hace que esta etiqueta se vuelva visible bajo el microscopio. La microscopía electrónica de barrido es una opción viable si el antígeno está en la superficie de la célula, pero puede ser necesaria la microscopía electrónica de transmisión para ver la etiqueta si el antígeno está dentro de la célula. ^[2]

Los antígenos y sus respectivos anticuerpos (normalmente dos) interactúan en la sección. ^[1] La microscopía electrónica de transmisión detecta entonces el anticuerpo y, por tanto, la proteína. El segundo anticuerpo suele estar unido al oro porque el oro tiene un número atómico elevado , lo que lo hace muy denso. Las partículas de oro coloidal hacen visibles los anticuerpos al conjugarse con ellos, porque se conoce su diámetro exacto. ^[3] Cuando los electrones pasan por el microscopio, chocan con esta partícula de oro. El átomo de oro denso refleja los electrones que se emiten desde el microscopio electrónico y provoca la aparición de la partícula objetivo dentro de la muestra. ^[1]

Otro proceso posible implica la proteína A , que se deriva de una bacteria . Recubre permanentemente el átomo de oro y se une a la región constante de los anticuerpos. Este proceso utiliza la proteína A como reemplazo de la secundaria y, en consecuencia, solo requiere un anticuerpo. La proteína A hace visible la proteína objetivo. Por lo tanto, todo el proceso da como resultado la localización y visualización de la proteína objetivo. ^[1]

Al utilizar la microscopía inmunoelectrónica, la muestra puede estar en secciones delgadas para que los electrones puedan penetrarla o teñida negativamente. La tinción negativa tiene una resolución más alta, pero solo puede identificar moléculas que serían reconocibles si estuvieran solas. Cuando se utiliza en la microscopía inmunoelectrónica, la tinción negativa implanta una partícula pequeña en la muestra, lo que permite resolver mejor las estructuras dentro de ella. El beneficio de la microscopía inmunoelectrónica es que permite el reconocimiento de partículas sin importar el contexto. ^[4]

Las secciones bajo el microscopio deben ser muy delgadas para permitir el paso de los electrones. Pueden surgir algunas complicaciones durante los pasos de preparación necesarios para crear las secciones delgadas, incluida la fijación química y la inclusión (generalmente en plástico). Estas preparaciones agresivas pueden desnaturalizar los antígenos, interrumpiendo su enlace necesario con los anticuerpos. Los investigadores han inventado y utilizado procesos específicos para evitar estos problemas y preservar la interacción entre el antígeno y los anticuerpos. Estos métodos incluyen la fijación con luz en lugar de la fijación química, la congelación de la muestra antes de seccionarla y la incubación a temperatura ambiente en lugar de a altas temperaturas. ^[1]

Los enlaces entre los anticuerpos y sus respectivos antígenos o entre los anticuerpos y sus marcadores de oro pueden ser solo parcialmente seguros debido a los efectos de las bajas concentraciones o del impedimento estérico en la unión. Los grupos de control son esenciales para tener en cuenta la cantidad de marcaje que se produce de forma natural sin un virus. ^[5]

Los resultados de la microscopía electrónica inmunitaria se cuantifican normalmente de forma visual. La muestra debe tener ciertas características para que el análisis cuantitativo sea eficaz, lo que limita su frecuencia de uso. Es aplicable en situaciones como ver cuántas partículas de oro coloidal están unidas a un anticuerpo en particular. ^[5] Durante experimentos exitosos, la microscopía electrónica inmunitaria puede localizar proteínas con precisión y fortalecer la comprensión de la relación entre la estructura y la función. Estos procesos de etiquetado y localización ayudan a los investigadores a comprender diversas vías y procesos celulares. ^[3]

Los protocolos de fijación e inclusión en microscopía electrónica afectan fuertemente los resultados de la formación de complejos inmunes: muchos procedimientos de fijación y procesamiento de la microscopía electrónica, como la serie de deshidratación que conduce a la polimerización en plástico Epon, o la reticulación de proteínas con glutaraldehído-formaldehído, no permiten la unión de un anticuerpo a su objetivo anterior. En un artículo se demostró que el mantenimiento de los sitios de unión activos, a través de un procedimiento suave de fijación e inclusión en microscopía electrónica, reveló que el transporte citoplasmático que anteriormente se creía que ocurría a través de microvesículas era en realidad un artefacto de preparación, que surgía de un anticuerpo marcado con peroxidasa utilizado antes de la fijación: el marcado directo con inmunooro en secciones de microscopía electrónica con Lowicryl mostró transporte citoplasmático sin vesículas en los tejidos ováricos. ^[6] .

1987:216A:395-401. Adv Exp Med Biol \1987:216A:395-401. doi: 10.1007/978-1-4684-5344-7_45.

En 1931, Ernst Ruska (premio Nobel en 1986) y Max Knoll crearon el primer microscopio electrónico. Esta invención dio origen al microscopio electrónico de barrido y al microscopio electrónico de transmisión, que más tarde contribuyeron a la microscopía inmunoelectrónica. Al principio, la tecnología solo permitía obtener imágenes bidimensionales, pero ahora, con la tecnología moderna, también se pueden obtener imágenes tridimensionales. ^[3]

La microscopía inmunoelectrónica surgió cuando dos grupos independientes combinaron en la década de 1940 el virus del mosaico del tabaco y su antisuero. Luego lo examinaron con un microscopio electrónico. En ese momento, la resolución era mucho peor debido a la falta de contraste adicional y a la mala calidad de los microscopios de la época. Se sabía que las partículas utilizadas en el experimento tenían forma de varillas, y ambos grupos de investigadores descubrieron que estas se agrupaban en un grupo de aproximadamente el doble de su tamaño original. Más de una década y media después, los investigadores comenzaron a utilizar anticuerpos singulares unidos a los virus. Finalmente, en 1962, aparecieron los anticuerpos con tinción negativa. ^[4]

La microscopía electrónica de transmisión proporciona información general sobre la estructura, pero tiene dificultades para diferenciar partes más detalladas de un virus o una célula. La microscopía inmunoelectrónica ayuda a diagnosticar infecciones virales y localizar antígenos virales en vacunas. ^[5] La microscopía inmunoelectrónica puede diagnosticar enfermedades e identificar patógenos de manera suficiente . Un ejemplo es su capacidad para representar la destrucción de la mielina en la membrana basal . Este daño puede estar asociado con impulsos nerviosos más lentos, lo que da como resultado una amplia gama de problemas cognitivos y físicos. Otro ejemplo incluye la identificación de lesiones cutáneas . En este caso, los científicos descubrieron fibrillas de anclaje insuficientes en la membrana basal, lo que provocó que la piel fuera más frágil. En ambos casos, los científicos identificaron un antígeno específico al que apuntar para usar la microscopía inmunoelectrónica para descubrir y aprender más sobre estas enfermedades. ^[7]

Inicialmente, las biopsias renales utilizaban microscopía de inmunofluorescencia, que proporcionaba una resolución menor que la microscopía inmunoelectrónica. Antes de cambiar de la microscopía óptica a la microscopía electrónica, los resultados mostraban numerosas biopsias que requerían una microscopía electrónica adicional para asegurar un diagnóstico más preciso. El uso adicional de la microscopía inmunoelectrónica se produjo tanto para hacer el diagnóstico inicial como para confirmar los hallazgos de la microscopía óptica. Los científicos decidieron completar un estudio de investigación sobre la eficacia de cada tipo de microscopía. En muchos casos, utilizando solo microscopía óptica, los médicos no pudieron hacer un diagnóstico inicial. Algunos incluso tenían diagnósticos incorrectos. El tipo de diagnóstico también jugó un papel crucial en el experimento. La microscopía óptica de fluorescencia identificó con precisión algunos diagnósticos sin necesidad de seguimiento. Otros eran mucho más difíciles de diferenciar y necesitaban microscopía electrónica. Incluso en los pacientes en los que la microscopía de inmunofluorescencia arrojó los resultados correctos, los investigadores todavía creían que era necesaria la confirmación. Los resultados de este estudio demostraron la necesidad de cambiar de la microscopía óptica a la microscopía electrónica para el diagnóstico de la biopsia renal. ^[8]