Microscopía de expansión

La microscopía de expansión (ExM) es una herramienta de preparación de muestras para muestras biológicas que permite a los investigadores identificar estructuras pequeñas expandiéndolas utilizando un sistema de polímeros . ^[1] La premisa es introducir una red de polímeros en muestras celulares o de tejido y luego expandir físicamente esa red de polímeros utilizando reacciones químicas para aumentar el tamaño de las estructuras biológicas. Entre otros beneficios, ExM permite obtener imágenes de esas pequeñas estructuras con una gama más amplia de técnicas de microscopía. Fue propuesta por primera vez en un artículo de 2015 por Fei Chen, Paul W. Tillberg y Edward Boyden . ^[2] La investigación actual permite la expansión de muestras hasta 16 veces más grandes que su tamaño inicial. ^[3] Esta técnica ha resultado útil en varios entornos de laboratorio, como el análisis de moléculas biológicas. ExM permite a los investigadores utilizar equipos estándar para identificar estructuras pequeñas, pero requiere el seguimiento de procedimientos para garantizar resultados claros.

La microscopía óptica tradicional tiene límites de resolución que le impiden distinguir de manera confiable estructuras pequeñas que son importantes para la función biológica, y en su lugar deben ser fotografiadas mediante una técnica de mayor resolución, como la microscopía electrónica . Por ejemplo, las vesículas sinápticas tienen un diámetro de 40 a 50 nanómetros, que está por debajo del límite de resolución comúnmente citado de 200 nanómetros para la microscopía óptica. ^[4] La microscopía de expansión resuelve este problema al expandir la muestra de tejido subyacente. Una ventaja clave de las muestras preparadas mediante microscopía de expansión y microscopía óptica sobre la microscopía electrónica convencional es que también permite a los investigadores teñir y visualizar moléculas particulares en la muestra, como proteínas específicas o ARN para identificar su densidad y distribución en relación con las estructuras biológicas de interés. El principio más beneficioso de la microscopía de expansión es que no requiere equipo especializado; ^[5] los materiales para la expansión valen poco o nada en comparación con el precio de un microscopio que podría obtener la misma resolución.

La microscopía de expansión es un proceso de varios pasos que, según el protocolo, tiene diferentes requisitos para la gelificación y la expansión. La secuencia de pasos es teñir, unir, digerir y expandir. ^[5] El proceso de tinción puede adoptar muchas formas diferentes y solo requiere que los fluoróforos utilizados puedan unirse al polímero en el siguiente paso. La unión es el proceso de agregar un gel de polímero a las células, que permeabilizan a través de la célula. El paso de unión también incluye, como sugiere el nombre, el proceso de unir los fluoróforos al gel. El paso de digestión implica agregar una solución que digiere la célula, eliminando la estructura de la célula. Si este paso falla, el gel no se expandirá de manera uniforme porque la célula intentará permanecer unida. El fracaso de este paso también puede causar grietas o fracturas en la célula. ^[6] Por último, la expansión hace que el gel se expanda físicamente en todas las direcciones, lo que hace que los fluoróforos que están unidos al gel también se expandan.

En 2015, Chen, Tillberg y Boyden, todos del MIT , describieron por primera vez la microscopía de expansión como un método para mejorar la resolución de la microscopía al hinchar una muestra en lugar de utilizar equipos de mayor resolución. ^[2] Desde entonces, el uso de ExM ha seguido creciendo. La novedad de la técnica significa que se han desarrollado pocas aplicaciones. El uso más común es en muestras biológicas.

En 2016, se publicaron varios artículos que detallaban soluciones alternativas a la limitación tradicional de ExM de etiquetar sondas. Estos cambios propusieron una forma de utilizar ExM con sondas de microscopía convencionales, lo que permitió un uso más amplio. En 2016, estos nuevos métodos de etiquetado se aplicaron para permitir la microscopía de fluorescencia de moléculas de ARN, lo que a su vez condujo a una secuenciación in situ espacialmente precisa, a saber, ExSeq (secuenciación de expansión), en 2021. ^[7]

Incluso con la microscopía de expansión, las placas de beta- amiloide relacionadas con la enfermedad de Alzheimer no se pueden resolver. Boyden ideó la "microscopía reveladora de expansión" en 2022, agregando marcadores fluorescentes después de la expansión en lugar de antes. Reemplazó las enzimas con calor. Esto permitió una expansión de hasta 20 veces, sin dañar las proteínas. Se ha utilizado para revelar detalles de las sinapsis y para arrojar luz sobre la enfermedad de Alzheimer, revelando espirales ocasionales de proteína beta-amiloide alrededor de los axones , que son las partes filiformes de las células nerviosas que transmiten impulsos eléctricos. ^[8]

La microscopía de expansión se logra sintetizando un sistema de polímeros dentro de una muestra. Luego, al hinchar esta red de polímeros, la muestra se expande para examinarla con herramientas de análisis microscópico convencionales sin degradar la integridad de la muestra. Esto permite analizar una muestra con un microscopio menos potente del que se necesitaría sin expansión y hace que el análisis de muestras biológicas microscópicas sea más accesible para laboratorios que, de otro modo, no habrían podido costear u obtener la tecnología de microscopía potente necesaria. ^[4]

La microscopía de expansión es un método que mejora la resolución de la imagen final durante la microscopía regular al ampliar físicamente el organismo, el tejido o la molécula en sí. Después de la ampliación del organismo, el tejido o la molécula, los microscopios más estándar pueden lograr imágenes de mayor resolución de propiedades fisiológicas más pequeñas. Los campos principales en los que se utiliza este método son aquellos involucrados en el análisis de muestras biológicas con la adición de inmunotinción o tintes fluorescentes. ^[9] Los marcadores fluorescentes se aplican después de la microscopía de expansión para hacer visibles grupos densos de proteínas y moléculas. ^[10] Sin embargo, esta técnica desde entonces se ha adoptado en muchos campos diferentes de investigación y continúa creciendo y aplicándose en cada vez más entornos de laboratorio.

Antes del descubrimiento de la microscopía de expansión, el examen de las estructuras celulares y biomoléculas se hacía mediante microscopía limitada por difracción. Se utilizaban principalmente para diagnosticar o investigar la patogénesis de una amplia variedad de estados de predisposición y enfermedad. Sin embargo, las biomoléculas tienen dimensiones nanométricas y se encuentran ubicadas con precisión nanométrica en todas las células y tejidos. Se utilizaban varias técnicas, como la microscopía de superresolución , pero estas requerían un hardware complejo y eran difíciles de aplicar a los tejidos humanos. Por lo tanto, se desarrolló la microscopía de expansión. Este método magnificaba físicamente las muestras de tejido en lugar de hacerlo ópticamente y, como resultado, podía producir imágenes de alta resolución. Estas imágenes de alta calidad de los tejidos sirvieron como un punto de inflexión en la microscopía de expansión diagnóstica y médica. ^[11]

Al igual que muchas otras técnicas, la microscopía de expansión también posee muchos potenciales en los campos médicos y de diagnóstico. La microscopía de expansión mejora la resolución de la microscopía óptica al expandir físicamente las muestras. Cuando esta técnica se aplica a las muestras de tejido clínico, se obtienen imágenes a escala nanométrica de muestras de tejido humano. En primer lugar, la patología de expansión se utiliza para convertir las muestras clínicas en un estado compatible para la microscopía de expansión. Este proceso se puede utilizar para el diagnóstico óptico de la enfermedad renal de cambios mínimos , lesiones neoplásicas mamarias tempranas y para detectar la diferencia entre muestras de tejido humano normal y muestras de tejido canceroso, lo que permite un uso rutinario en la investigación clínica. ^[12] El uso de la microscopía de expansión patógena permitió obtener imágenes claras del tejido. La aplicación de la microscopía de expansión en microarreglos que contienen muestras de varios órganos, como mama, próstata, pulmón, colon, páncreas, riñón, hígado y ovario, incluidos tejidos normales y cancerosos, permitió el diagnóstico y el examen de la red celular de tejidos en estado patológico. Esta imagen revela características de tamaño sub-límite de difracción de los filamentos intermedios de queratina y vimentina , críticos en la transición epitelial-mesenquimal, la progresión del cáncer y el inicio de la metástasis. ^[11]

En el futuro, tras un mayor desarrollo de esta técnica, se prevé que se pueda observar la morfología a nanoescala de biomoléculas y muestras de una amplia gama de órganos humanos.

Muchas de las preguntas que rodean a la neurociencia intentan responder y comprender las moléculas y el cableado de los circuitos neuronales . Sin embargo, mapear estas estructuras en las grandes escalas de los circuitos neuronales es difícil. En estos casos, ExM magnifica especímenes biológicos como los circuitos cerebrales y permite mapearlos más fácilmente. Las biomoléculas , como las proteínas y los ácidos nucleicos, se anclan al polímero, que luego se hincha para expandir las biomoléculas. Debido a la mayor distancia entre las biomoléculas, los microscopios ordinarios pueden realizar imágenes con resolución nanométrica. Mediante el uso de la técnica ExM, los neurocientíficos pueden mapear más fácilmente imágenes de sinapsis, células y circuitos neuronales. ^[13]

Con el desarrollo de la microscopía de expansión, los científicos han comenzado a crear subconjuntos de la técnica, incluida la microscopía de expansión Joule de barrido o SJEM. La SJEM utiliza una técnica de imagen térmica que mide la expansión térmica de los elementos calentados por Joule. Una de las mayores ventajas de la SJEM sobre las técnicas de imagen térmica submicrónica más antiguas es que la SJEM no requiere la nanofabricación de sondas especializadas. En cambio, la SJEM solo requiere un microscopio de fuerza atómica estándar y electrónica simple. ^[14]

Una de las ventajas más significativas de la microscopía de expansión en comparación con otras formas de microscopía es que no requiere un equipo óptico más potente para realizar imágenes de alta resolución. Debido a que la microscopía de expansión amplía la muestra física, libera a los investigadores de la necesidad de comprar un costoso equipo de microscopía, como microscopios electrónicos, para estudios de súper resolución. Al expandir la muestra, se vuelve más fácil de examinar, ya que las estructuras más grandes se pueden examinar utilizando técnicas de microscopía tradicionales, como la microscopía óptica.

Cada uno de los cuatro pasos de preparación de ExM debe completarse por completo, o la célula no producirá una tinción brillante y clara. Si no se completan estos pasos, la célula puede romperse o expandirse de manera desigual, distorsionando la imagen y haciendo que no pueda usarse. ExM tiene dificultades en aquellos procedimientos que utilizan marcadores fluoróforos , ya que el proceso de polimerización puede blanquear estos fluoróforos, volviéndolos inutilizables. Hay algunos, como Alexa 488 y Atto 565, que siguen siendo efectivos después de la polimerización, sin embargo, su eficacia se reduce en gran medida a aproximadamente el 50%. La conjugación de ADN con otro anticuerpo suele ser muy costosa y difícil. Estos dos problemas son las principales limitaciones para usar ExM en muestras biológicas. ^[15] Es importante señalar que, si bien la unión de nuevos anticuerpos puede ser costosa y llevar mucho tiempo, a veces es posible, después de la expansión, en casos en los que el anticuerpo tiene dificultades para unirse en tejido denso. Después de la expansión, el tejido es mucho menos denso y, a menudo, permite una mejor recepción de los anticuerpos fluorescentes.