Tinción de endosporas

La tinción de endosporas es una técnica utilizada en bacteriología para identificar la presencia de endosporas en una muestra bacteriana. ^[1] Dentro de las bacterias, las endosporas son estructuras protectoras que se utilizan para sobrevivir a condiciones extremas, incluidas las altas temperaturas, lo que las hace muy resistentes a los productos químicos. ^[2] Las endosporas contienen poco o nada de ATP, lo que indica qué tan inactivas pueden estar. Las endosporas contienen una capa externa resistente compuesta de queratina que las protege del ADN nucleico y otras adaptaciones. Las endosporas pueden regerminar en células vegetativas, lo que les proporciona una naturaleza protectora que las hace difíciles de teñir utilizando técnicas normales como la tinción simple y la tinción de Gram . Las técnicas especiales para la tinción de endosporas incluyen la tinción de Schaeffer-Fulton y la tinción de Moeller .

Las endosporas fueron estudiadas por primera vez en 1876 por los científicos Cohn y Koch . ^[3] Se descubrió que las endosporas no se podían teñir con colorantes simples como el azul de metileno , la safranina y la fucsina carbólica . Estos científicos, junto con algunos otros, descubrieron que las esporas eran latentes y resistentes al calor. A principios de la década de 1900, los investigadores estaban tratando de encontrar métodos alternativos para mejorar las enfermedades y las infecciones causadas por estas endosporas. ^[3]

En 1922, Dorner publicó un método para teñir endosporas. Encontró una técnica de tinción diferencial en la que las endosporas aparecen de color verde y las células vegetativas de color rojo rosado. ^[4] Dorner utilizó calor como un paso en el proceso, pero consumía mucho tiempo, por lo que en 1933, Schaeffer y Fulton modificaron su método.

Schaeffer y Fulton aceleraron mucho el proceso de calentamiento utilizando un mechero Bunsen . Aunque este método no era el más beneficioso, era mucho más conveniente que el método de Dorner. Este método mejorado proporcionaba una prueba más rápida y sencilla y permitía que las esporas fueran más susceptibles a los colorantes. ^[4] Hasta el día de hoy, la tinción de Schaeffer-Fulton todavía se realiza para ayudar a identificar bacterias.

Las endosporas pueden sobrevivir durante décadas en múltiples condiciones adversas, como la desecación y la congelación. Esto se debe a que el ADN dentro de la endospora puede sobrevivir durante un largo período de tiempo. La mayoría de las bacterias no pueden formar endosporas debido a su alta resistencia, pero algunas especies comunes son los géneros Bacillus (más de 100 especies) y Clostridium (más de 160 especies). ^[2]

• Bacillus anthraces , que causa el ántrax ^[5]
• Bacillus cereus - Puede causar dos tipos de intoxicación alimentaria: emética y diarreica ^[2]
• Bacillus subtilis - Se encuentra en el suelo ^[5]
• Clostridium tetani , espora que causa tétanos y parálisis rígida.
• Clostridium botulinum : espora presente en alimentos que no han sido enlatados adecuadamente. El Clostridium botulinum a veces se vende como bótox y evita la transmisión nerviosa.
• Clostridium difficile : provoca inflamación en el colon, generalmente por otros antibióticos. Los síntomas incluyen diarrea, dolor abdominal y fiebre. ^[6]

Los tipos de endosporas que se pueden identificar incluyen endosporas libres, endosporas centrales (en el medio de la célula), endosporas subterminales (entre el extremo y el medio de la célula) y endosporas terminales (en el extremo de la célula). También puede haber una combinación de endosporas terminales o subterminales. Las endosporas se pueden diferenciar según la forma, ya sea esférica o elíptica (ovalada), el tamaño en relación con la célula y si hacen que la célula se vea hinchada o no. ^[2]

En el método de tinción de Schaeffer-Fulton , se introduce en la espora una tinción primaria que contiene verde malaquita al vaporizar la bacteria. El verde malaquita se puede dejar en el portaobjetos durante 15 minutos o más para teñir las esporas. Las esporas tardan mucho en teñirse debido a su densidad, por lo que el calor actúa como mordiente al realizar esta tinción diferencial. El verde malaquita es soluble en agua, por lo que las células vegetativas y las células madre de las esporas se pueden decolorar con agua destilada y contrateñir con safranina al 0,5 % . ^[7] Al final, un frotis adecuado mostraría la endospora como un punto verde dentro de una célula de color rojo o rosa. ^[2]

La micobacteria es un obstáculo al que se enfrenta este tipo de proceso de tinción, ya que se tiñe de verde aunque no produzca endosporas. Esto se debe a su pared celular cerosa, que retiene el colorante verde malaquita incluso después del proceso de decoloración. Para obtener más información sobre este tipo particular de bacteria, será necesario realizar un tipo diferente de tinción, denominada tinción acidorresistente .

Fuente: ^[2]

1. Utilizando una técnica aséptica, prepare y seque al aire un portaobjetos fijado con calor con el organismo deseado.
2. Preparar un baño de agua hirviendo.
3. Cubra el portaobjetos con un trozo de toalla de papel y colóquelo en una rejilla de tinción sobre el baño de agua.
4. Inunde la toalla de papel sobre el portaobjetos con verde malaquita (tinción primaria).
5. Cocine al vapor el portaobjetos durante 5 a 7 minutos (mordiente).
6. Transcurrido el tiempo, retira con cuidado el portaobjetos del baño de agua utilizando pinzas. Retira la toalla de papel.
7. Deje que el portaobjetos se enfríe y luego, utilizando las pinzas sobre el soporte de tinción, enjuague suavemente con agua destilada hasta que el líquido salga transparente (decolorante).
8. Escurre el exceso de agua y coloca el portaobjetos en la rejilla de tinción e inúndalo con safranina (tinción de contraste) durante un minuto.
9. Enjuague suavemente el exceso de safranina con agua destilada y seque cuidadosamente ambos lados.
10. Cuando el portaobjetos esté seco, obsérvelo bajo el microscopio con el objetivo de inmersión en aceite (100X).