Ácido nucleico bloqueado
Molécula biológica
Estructura química de un monómero LNA un puente adicional une el oxígeno 2' y el carbono 4' de la pentosa

Un ácido nucleico bloqueado ( LNA ), también conocido como ácido nucleico puenteado (BNA), [1] y a menudo denominado ARN inaccesible , es un nucleótido de ARN modificado en el que la fracción de ribosa se modifica con un puente adicional que conecta el oxígeno 2' y el carbono 4'. El puente "bloquea" la ribosa en la conformación 3'- endo (North), que a menudo se encuentra en los dúplex de forma A. Esta estructura proporciona una mayor estabilidad contra la degradación enzimática. [2] [3] [4] [5] El LNA también ofrece una especificidad y afinidad mejoradas en el apareamiento de bases como monómero o componente de un oligonucleótido. [6] Los nucleótidos de LNA se pueden mezclar con residuos de ADN o ARN en un oligonucleótido.

Síntesis

Obika et al. fueron los primeros en sintetizar químicamente LNA en 1997, [7] seguidos independientemente por el grupo de Jesper Wengel en 1998. [8] Esto fue posible después de que Zamecnick y Stephenson sentaran las bases sobre la posibilidad de que los oligonucleótidos fueran grandes agentes para controlar la expresión génica en 1978. [9] Hasta la fecha, se ha demostrado que dos enfoques diferentes, denominados estrategias lineal y convergente respectivamente, producen LNA de alto rendimiento y eficientes. La estrategia lineal de síntesis se detalló por primera vez en los trabajos de Obika et al. [7] En este enfoque, se puede utilizar uridina (o cualquier nucleósido de ARN fácilmente disponible) como material de partida. La estrategia convergente requiere la síntesis de un intermedio de azúcar que sirva como donante de glicosilo necesario para el acoplamiento con nucleobases . Comúnmente, se utiliza D-glucosa para producir el intermedio de azúcar que posteriormente se hace reaccionar con nucleobases utilizando un procedimiento Vorbrügen modificado que permite el acoplamiento estereoselectivo. [10]

La adición de diferentes fracciones sigue siendo una posibilidad manteniendo propiedades fisicoquímicas clave como la alta afinidad y especificidad evidentes en el LNA sintetizado originalmente. [8] Dichos oligómeros se sintetizan químicamente y están disponibles comercialmente.

Incorporación al ADN/ARN

El LNA se puede incorporar al ADN y al ARN utilizando la promiscuidad de ciertas polimerasas de ADN y ARN. La ADN polimerasa Phusion, una enzima diseñada comercialmente basada en una ADN polimerasa Pfu , incorpora eficazmente el LNA al ADN. [11]

Propiedades

El LNA ofrece una bioestabilidad mejorada en comparación con los ácidos nucleicos biológicos . Los oligonucleótidos modificados con LNA han demostrado una termodinámica mejorada en la hibridación con ARN , ADNmc y ADNdc . [11]

Aplicaciones

LNAzimas

Las enzimas de ADN pueden modificarse para incluir residuos de LNA, lo que produce enzimas de ADN modificadas con LNA. Estos oligonucleótidos modificados, al igual que sus parientes, las enzimas de ADN, son generalmente endonucleasas que se unen a secuencias de ARN diana específicas y cortan el enlace fosfodiéster que existe entre los nucleótidos. [12] Sin embargo, demuestran una escisión más eficiente de los enlaces fosfodiéster en comparación con sus contrapartes no modificadas. [13] La modificación de los brazos de reconocimiento de sustrato de las enzimas de ADN con monómeros de LNA produce una enzima de ADN que reconoce el virus Coxsackie A21 (CAV-21) y corta su secuencia de ARN diana similar a una en la región no traducida 5' (5' UTR) del rinovirus humano -14 (HRV-14); una secuencia no reconocida por las enzimas de ADN no modificadas. [14]

Terapéutica

El uso terapéutico de oligonucleótidos basados ​​en LNA es un campo emergente en la biotecnología . [15] Se han evaluado diversos oligonucleótidos de LNA en cuanto a sus perfiles farmacocinéticos y de toxicidad. Los estudios concluyeron que la toxicidad de los LNA es generalmente independiente de la secuencia de oligonucleótidos y muestra un perfil de seguridad preferencial para aplicaciones terapéuticas traducibles. [8]

Se han investigado las propiedades terapéuticas del LNA en el tratamiento de cánceres y enfermedades infecciosas. Se ha desarrollado una molécula antisentido de fosforotioato de ácido nucleico bloqueado, denominada SPC2996, para atacar el ARNm que codifica la oncoproteína Bcl-2, una proteína que inhibe la apoptosis en las células de leucemia linfocítica crónica (LLC). Los ensayos clínicos de fase I y II demostraron una reducción dependiente de la dosis en las células de LCC circulantes en aproximadamente el 30% de la población de muestra, lo que sugiere una mayor investigación sobre SPC2996. [16]

El LNA también se ha aplicado a Miravirsen , un fármaco experimental destinado al tratamiento de la hepatitis C , que constituye una secuencia de fosforotioato de 15 nucleótidos con especificidad de unión para MiR-122 (un miRNA expresado en los hepatocitos ). [17] [18]

Detección y diagnóstico

La PCR específica de alelos utilizando LNA permite el diseño de cebadores más cortos, sin comprometer la especificidad de unión. [19]

El LNA se ha incorporado en la hibridación in situ con fluorescencia (FISH) . [20] La FISH es una técnica común utilizada para visualizar material genético en una variedad de células, pero los estudios observaron que esta técnica ha estado limitada por la baja eficiencia de hibridación de la sonda. Por el contrario, las sondas incorporadas con LNA demostraron una mayor eficiencia de hibridación tanto en ADN como en ARN . La eficiencia mejorada de la FISH incorporada con LNA ha dado como resultado el análisis FISH del cromosoma humano, varios tipos de células no humanas y microarrays. [20]

También se han realizado ensayos de genotipificación de LNA, específicamente para detectar una mutación en la apolipoproteína B. [20]

Por su alta afinidad para la discriminación de desajustes, el LNA se ha estudiado para sus aplicaciones en herramientas de diagnóstico. Se han introducido sondas de LNA inmovilizadas en un ensayo de genotipado de SNP multiplex . [15]

Edición genética

Los oligonucleótidos de ADN monocatenario sintéticos modificados con LNA se pueden utilizar como los oligonucleótidos de ADN monocatenario ordinarios para la edición de genes de una sola base. El uso de LNA en el sitio de modificación previsto o cerca de él permite evitar la reparación de los errores de apareamiento del ADN debido a su mayor estabilidad termodinámica. [21]

Referencias

  1. ^ Elayadi, Anissa N.; Braasch, Dwaine A.; Corey, David R. (agosto de 2002). "Implicaciones de la hibridación de alta afinidad por oligómeros de ácidos nucleicos bloqueados para la inhibición de la telomerasa humana †". Bioquímica . 41 (31): 9973–9981. doi :10.1021/bi025907j. ISSN  0006-2960. PMID  12146961.
  2. ^ Kurreck, J. (1 de mayo de 2002). "Diseño de oligonucleótidos antisentido estabilizados por ácidos nucleicos bloqueados". Nucleic Acids Research . 30 (9): 1911–1918. doi :10.1093/nar/30.9.1911. PMC 113840 . PMID  11972327. 
  3. ^ Frieden, M. (1 de noviembre de 2003). "Ampliando el horizonte de diseño de oligonucleótidos antisentido con alfa-L-LNA". Nucleic Acids Research . 31 (21): 6365–6372. doi :10.1093/nar/gkg820. ISSN  1362-4962. PMC 275462 . PMID  14576324. 
  4. ^ Frieden, Miriam; Hansen, Henrik F.; Koch, Troels (octubre de 2003). "Estabilidad de la nucleasa de oligonucleótidos LNA y quimeras LNA-ADN". Nucleósidos, nucleótidos y ácidos nucleicos . 22 (5–8): 1041–1043. doi :10.1081/NCN-120022731. ISSN  1525-7770. PMID  14565339. S2CID  10631717.
  5. ^ Morita, K.; Hasegawa, C.; Kaneko, M.; Tsutsumi, S.; Sone, J.; Ishikawa, T.; Imanishi, T.; Koizumi, M. (1 de noviembre de 2001). "Ácidos nucleicos con puentes de 2'-O, 4'-C-etileno (ENA) con resistencia a las nucleasas y alta afinidad por el ARN". Serie de simposios sobre ácidos nucleicos . 1 (1): 241–242. doi : 10.1093/nass/1.1.241 . ISSN  0261-3166. PMID  12836354.
  6. ^ Veedu, Rakesh; Wengel, Jesper (2011). Química medicinal de los ácidos nucleicos . John Wiley & Sons, Inc., págs. 335-337. ISBN 978-0470596685.
  7. ^ ab Obika, Satoshi; Nanbu, Daishu; Hari, Yoshiyuki; Morio, Ken-ichiro; En, Yasuko; Ishida, Toshimasa; Imanishi, Takeshi (15 de diciembre de 1997). "Síntesis de 2′-O,4′-C-metilenuridina y -citidina. Nuevos nucleósidos bicíclicos que tienen un fruncimiento de azúcar endo C3 fijo". Letras de tetraedro . 38 (50): 8735–8738. doi :10.1016/S0040-4039(97)10322-7. ISSN  0040-4039.
  8. ^ abc Orum, Miriam Frieden y Henrik (31 de marzo de 2008). "El ácido nucleico bloqueado es prometedor en el tratamiento del cáncer". Current Pharmaceutical Design . 14 (11): 1138–1142. doi :10.2174/138161208784246234. PMID  18473860 . Consultado el 6 de octubre de 2020 .
  9. ^ Zamecnik, PC; Stephenson, ML (1978-01-01). "Inhibición de la replicación del virus del sarcoma de Rous y transformación celular por un oligodesoxinucleótido específico". Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 75 (1): 280–284. Bibcode :1978PNAS...75..280Z. doi : 10.1073/pnas.75.1.280 . ISSN  0027-8424. PMC 411230 . PMID  75545. 
  10. ^ Koshkin, Alexei A.; Fensholdt, Jef; Pfundheller, Henrik M.; Lomholt, Christian (1 de diciembre de 2001). "Una ruta simplificada y eficiente para ribonucleósidos bicíclicos unidos a 2'-O, 4'-C-metileno (ácido nucleico bloqueado)". The Journal of Organic Chemistry . 66 (25): 8504–8512. doi :10.1021/jo010732p. ISSN  0022-3263. PMID  11735531.
  11. ^ ab Veedu, Rakesh N.; Vester, Birte; Wengel, Jesper (26 de marzo de 2007). "Incorporación enzimática de nucleótidos de LNA en hebras de ADN". ChemBioChem . 8 (5): 490–492. doi :10.1002/cbic.200600501. PMID  17315250. S2CID  10206060.
  12. ^ Breaker, RR; Joyce, GF (diciembre de 1994). "Una enzima de ADN que corta el ARN". Química y biología . 1 (4): 223–229. doi :10.1016/1074-5521(94)90014-0. ISSN  1074-5521. PMID  9383394.
  13. ^ Vester, Birte; Lundberg, Lars Bo; Sørensen, Mads D.; Babu, B. Ravindra; Douthwaite, Stephen; Wengel, Jesper (noviembre de 2002). "LNAzimas: la incorporación de monómeros de tipo LNA en ADNzimas aumenta notablemente la escisión del ARN". Revista de la Sociedad Química Estadounidense . 124 (46): 13682–13683. doi :10.1021/ja0276220. ISSN  0002-7863. PMID  12431091.
  14. ^ Schubert, Steffen; Fürste, Jens P; Trabajo, Denise; Grunert, Hans-Peter; Zeichhardt, Heinz; Erdmann, Volker A; Kurreck, Jens (mayo de 2004). "Obtener acceso objetivo para las desoxirribozimas". Revista de biología molecular . 339 (2): 355–363. doi :10.1016/j.jmb.2004.03.064. PMID  15136038.
  15. ^ ab Petersen M, Wengel J (febrero de 2003). "LNA: una herramienta versátil para la terapéutica y la genómica". Tendencias en biotecnología . 21 (2): 74–81. doi :10.1016/S0167-7799(02)00038-0. PMID  12573856.
  16. ^ Dürig, J.; Dührsen, U.; Klein-Hitpass, L.; Worm, J.; Hansen, JB Rode; Ørum, H.; Wissenbach, M. (abril de 2011). "El nuevo inhibidor antisentido de Bcl-2 SPC2996 provoca una rápida eliminación de células leucémicas y activación inmunitaria en la leucemia linfocítica crónica". Leucemia . 25 (4): 638–647. doi :10.1038/leu.2010.322. ISSN  1476-5551. PMID  21358717.
  17. ^ Gebert, Luca FR; Rebhan, Mario AE; Crivelli, Silvia EM; Denzler, Rémy; Stoffel, Markus; Salón, Jonathan (1 de enero de 2014). "Miravirsen (SPC3649) puede inhibir la biogénesis de miR-122". Investigación de ácidos nucleicos . 42 (1): 609–621. doi : 10.1093/nar/gkt852. ISSN  0305-1048. PMC 3874169 . PMID  24068553. 
  18. ^ Bonneau, E.; Neveu, B.; Kostantin, E.; Tsongalis, GJ; De Guire, V. (24 de junio de 2019). "¿Qué tan cerca están los miRNA de la práctica clínica? Una perspectiva sobre el mercado diagnóstico y terapéutico". EJIFCC . 30 (2): 114–127. ISSN  1650-3414. PMC 6599191 . PMID  31263388. 
  19. ^ Bonetta L (2005). "El mejor momento para la PCR en tiempo real". Nat. Methods . 2 (4): 305–312. doi : 10.1038/nmeth0405-305 . S2CID  17711047.
  20. ^ abc Kubota, Kengo; Ohashi, Akiyoshi; Imachi, Hiroyuki; Harada, Hideki (agosto de 2006). "Mejora de la eficiencia de la hibridación in situ con sondas de ADN con ácido nucleico bloqueado incorporado". Applied and Environmental Microbiology . 72 (8): 5311–5317. doi :10.1128/AEM.03039-05. ISSN  0099-2240. PMC 1538721 . PMID  16885281. 
  21. ^ van Ravesteyn, TW; Dekker, M; Fish, A; Sixma, TK; Wolters, A; Dekker, RJ; Te Riele, HP (12 de abril de 2016). "La modificación de oligonucleótidos de ADN monocatenario mediante LNA permite una modificación sutil de genes en células con capacidad de reparación de desajustes". Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 113 (15): 4122–7. doi : 10.1073/pnas.1513315113 . PMC 4839440 . PMID  26951689. 
Obtenido de "https://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Ácido_nucleico_bloqueado&oldid=1188098798"