Purificación de proteínas

La purificación de proteínas es una serie de procesos destinados a aislar una o unas pocas proteínas de una mezcla compleja, generalmente células , tejidos u organismos completos. La purificación de proteínas es vital para la especificación de la función, la estructura y las interacciones de la proteína de interés. El proceso de purificación puede separar las partes proteicas y no proteicas de la mezcla y, finalmente, separar la proteína deseada de todas las demás proteínas. Idealmente, para estudiar una proteína de interés, debe separarse de otros componentes de la célula para que los contaminantes no interfieran en el examen de la estructura y la función de la proteína de interés. ^[1] La separación de una proteína de todas las demás es típicamente el aspecto más laborioso de la purificación de proteínas. Los pasos de separación generalmente explotan las diferencias en el tamaño de la proteína, las propiedades fisicoquímicas, la afinidad de unión y la actividad biológica . El resultado puro puede denominarse aislado de proteína .

El costo de fabricación de proteínas sigue siendo alto y existe una creciente demanda de desarrollar métodos de purificación de proteínas rápidos y rentables. La comprensión de los diferentes métodos de purificación de proteínas y la optimización del procesamiento posterior son fundamentales para minimizar los costos de producción al tiempo que se mantiene la calidad de los estándares aceptables de homogeneidad. ^[2] La purificación de proteínas es preparativa o analítica . Las purificaciones preparativas tienen como objetivo producir una cantidad relativamente grande de proteínas purificadas para su uso posterior. Los ejemplos incluyen la preparación de productos comerciales como enzimas (p. ej. , lactasa ), proteínas nutricionales (p. ej. , aislado de proteína de soja ) y ciertos productos biofarmacéuticos (p. ej. , insulina ). A menudo se implementan varios pasos de purificación preparativa para eliminar subproductos, como proteínas de células huésped , que representan una amenaza potencial para la salud del paciente. ^[3] La purificación analítica produce una cantidad relativamente pequeña de una proteína para una variedad de propósitos de investigación o analíticos, que incluyen identificación, cuantificación y estudios de la estructura de la proteína , modificaciones postraduccionales y función. Cada paso de un esquema de purificación de proteínas se monitorea y tiene en cuenta los niveles de purificación y el rendimiento. Un alto nivel de purificación y un bajo rendimiento dejan muy pocas proteínas con las que experimentar. Por otro lado, un alto rendimiento con bajos niveles de purificación deja muchos contaminantes (proteínas distintas a la de interés) que interfieren en los objetivos de la investigación. ^[1]

Si la proteína de interés no es secretada por el organismo en la solución circundante, el primer paso de cada proceso de purificación es la disrupción de las células que contienen la proteína. Dependiendo de qué tan frágil sea la proteína y qué tan estables sean las células, se podría, por ejemplo, utilizar uno de los siguientes métodos: i) congelación y descongelación repetidas, ii) sonicación , iii) homogeneización por alta presión ( prensa francesa ), iv) homogeneización por molienda (molino de perlas), y v) permeabilización por detergentes (p. ej. Triton X-100 ) y/o enzimas (p. ej. lisozima ). ^[4] Finalmente, los restos celulares se pueden eliminar por centrifugación diferencial, que es un procedimiento en el que el homogeneizado se centrifuga a baja velocidad, luego nuevamente a una fuerza mayor para producir un pellet que consiste en núcleos y sobrenadante. Esto produce varias fracciones de densidad decreciente donde se aplican técnicas de purificación más discriminantes a una fracción. ^[1]

También se liberan proteasas durante la lisis celular , que comenzarán a digerir las proteínas en la solución. Si la proteína de interés es sensible a la proteólisis , se recomienda proceder rápidamente y mantener el extracto frío para ralentizar la digestión. Alternativamente, se pueden agregar uno o más inhibidores de proteasa al tampón de lisis inmediatamente antes de la disrupción celular. A veces también es necesario agregar ADNasa para reducir la viscosidad del lisado celular causada por un alto contenido de ADN .

La centrifugación es un proceso que utiliza la fuerza centrífuga para separar mezclas de partículas de masas o densidades variables suspendidas en un líquido. Cuando un recipiente (normalmente un tubo o una botella) que contiene una mezcla de proteínas u otras partículas, como células bacterianas, gira a alta velocidad, la inercia de cada partícula produce una fuerza en la dirección de la velocidad de la partícula que es proporcional a su masa. La tendencia de una partícula determinada a moverse a través del líquido debido a esta fuerza se ve compensada por la resistencia que el líquido ejerce sobre la partícula. El efecto neto de "hacer girar" la muestra en una centrífuga es que las partículas masivas, pequeñas y densas se mueven hacia afuera más rápido que las partículas menos masivas o las partículas con más "resistencia" en el líquido. Cuando se "hacen girar" suspensiones de partículas en una centrífuga, se puede formar un "gránulo" en el fondo del recipiente que se enriquece con las partículas más masivas con poca resistencia en el líquido.

Las partículas no compactadas permanecen principalmente en el líquido llamado "sobrenadante" y pueden ser retiradas del recipiente, separando así el sobrenadante del sedimento. La velocidad de centrifugación está determinada por la aceleración angular aplicada a la muestra, que normalmente se mide en comparación con la g . Si las muestras se centrifugan durante el tiempo suficiente, las partículas en el recipiente alcanzarán el equilibrio, en el que se acumulan específicamente en un punto del recipiente donde su densidad de flotación se equilibra con la fuerza centrífuga. Una centrifugación de "equilibrio" de este tipo puede permitir una purificación extensa de una partícula determinada.

La centrifugación en gradiente de sacarosa (un gradiente de concentración lineal de azúcar [normalmente sacarosa, glicerol o un medio de gradiente de densidad a base de sílice, como Percoll )) se genera en un tubo de modo que la concentración más alta se encuentra en la parte inferior y la más baja en la parte superior. Percoll es una marca comercial propiedad de las empresas de GE Healthcare. A continuación, se coloca una muestra de proteína en la parte superior del gradiente y se centrifuga a alta velocidad en una ultracentrífuga . Esto hace que las macromoléculas pesadas migren hacia el fondo del tubo más rápido que el material más ligero. Durante la centrifugación en ausencia de sacarosa, a medida que las partículas se alejan cada vez más del centro de rotación, experimentan cada vez más fuerza centrífuga (cuanto más se mueven, más rápido se mueven). El problema con esto es que el rango de separación útil dentro del recipiente está restringido a una pequeña ventana observable. Hacer girar una muestra el doble de tiempo no significa que la partícula de interés vaya el doble de lejos; de hecho, irá significativamente más lejos. Sin embargo, cuando las proteínas se mueven a través de un gradiente de sacarosa, se encuentran con un líquido de densidad y viscosidad crecientes. Un gradiente de sacarosa diseñado adecuadamente contrarrestará la creciente fuerza centrífuga, de modo que las partículas se muevan en proporción cercana al tiempo que han estado en el campo centrífugo. Las muestras separadas por estos gradientes se denominan centrifugaciones "zonales de velocidad". Después de separar las proteínas/partículas, el gradiente se fracciona y se recolecta. En bioquímica, la ultracentrifugación es valiosa para separar biomoléculas y analizar sus propiedades físicas. ^[1]

La elección de un material de partida es clave para el diseño de un proceso de purificación. En una planta o animal, una proteína particular normalmente no se distribuye de forma homogénea por todo el cuerpo; diferentes órganos o tejidos tienen concentraciones mayores o menores de la proteína. El uso solo de los tejidos u órganos con la concentración más alta disminuye los volúmenes necesarios para producir una cantidad dada de proteína purificada. Si la proteína está presente en baja abundancia, o si tiene un alto valor, los científicos pueden usar tecnología de ADN recombinante para desarrollar células que produzcan grandes cantidades de la proteína deseada (esto se conoce como un sistema de expresión ). La expresión recombinante permite que la proteína sea etiquetada, por ejemplo, por una etiqueta His ^[5] o Strep ^[6] para facilitar la purificación, reduciendo el número de pasos de purificación necesarios.

Una purificación analítica generalmente utiliza tres propiedades para separar las proteínas. En primer lugar, las proteínas pueden purificarse de acuerdo con sus puntos isoeléctricos pasándolas por un gel graduado en pH o una columna de intercambio iónico. En segundo lugar, las proteínas pueden separarse de acuerdo con su tamaño o peso molecular mediante cromatografía de exclusión por tamaño o mediante análisis SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio). Las proteínas a menudo se purifican mediante 2D-PAGE y luego se analizan mediante huella de masa de péptidos para establecer la identidad de la proteína. Esto es muy útil para fines científicos y los límites de detección de proteínas son hoy en día muy bajos y cantidades de proteína en nanogramos son suficientes para su análisis. En tercer lugar, las proteínas pueden separarse por polaridad/hidrofobicidad mediante cromatografía líquida de alto rendimiento o cromatografía de fase inversa .

Generalmente, un protocolo de purificación de proteínas contiene uno o más pasos cromatográficos. El procedimiento básico en cromatografía es hacer fluir la solución que contiene la proteína a través de una columna llena de diversos materiales. Las diferentes proteínas interactúan de manera diferente con el material de la columna y, por lo tanto, pueden separarse según el tiempo necesario para pasar por la columna o las condiciones necesarias para eluir la proteína de la columna. Por lo general, las proteínas se detectan cuando salen de la columna por su absorbancia a 280 nm. Existen muchos métodos cromatográficos diferentes:

La mayoría de las proteínas requieren algo de sal para disolverse en agua, un proceso llamado salazón. A medida que aumenta la concentración de sal, las proteínas pueden precipitar, un proceso llamado salazón que implica cambiar la solubilidad de las proteínas. ^[1] Por ejemplo, en la purificación de proteínas a granel, un primer paso común para aislar proteínas es la precipitación con sulfato de amonio (NH ₄ ) ₂ SO ₄ . ^[7] Esto se realiza añadiendo cantidades crecientes de sulfato de amonio y recogiendo las diferentes fracciones de proteína precipitada. Posteriormente, el sulfato de amonio se puede eliminar mediante diálisis (separando las proteínas de las moléculas pequeñas a través de una membrana semipermeable). ^[1] Durante el paso de precipitación con sulfato de amonio, los grupos hidrófobos presentes en las proteínas se exponen a la atmósfera, atrayendo a otros grupos hidrófobos; el resultado es la formación de un agregado de componentes hidrófobos. En este caso, el precipitado de proteína normalmente será visible a simple vista . Una ventaja de este método es que se puede realizar de forma económica, incluso con volúmenes muy grandes.

Las primeras proteínas que se purifican son las solubles en agua. La purificación de proteínas integrales de membrana requiere la ruptura de la membrana celular para aislar una proteína en particular de otras que se encuentran en el mismo compartimento de membrana. A veces, se puede aislar primero una fracción particular de la membrana, como aislar las mitocondrias de las células antes de purificar una proteína ubicada en una membrana mitocondrial. Se puede utilizar un detergente como el dodecil sulfato de sodio (SDS) para disolver las membranas celulares y mantener las proteínas de membrana en solución durante la purificación; sin embargo, debido a que el SDS causa desnaturalización , se pueden utilizar detergentes más suaves como Triton X-100 o CHAPS para conservar la conformación nativa de la proteína durante la purificación completa.

La cromatografía se puede utilizar para separar proteínas en solución o en condiciones desnaturalizantes mediante el uso de geles porosos. Esta técnica es una separación más discriminante y se conoce como cromatografía de exclusión por tamaño . El principio es que las moléculas más pequeñas tienen que atravesar un volumen mayor en una matriz porosa. En consecuencia, las proteínas de un cierto rango de tamaño requerirán un volumen variable de eluyente (disolvente) antes de ser recolectadas en el otro extremo de la columna de gel. Las moléculas más grandes (o proteínas) viajarán a través de un volumen menor y se eluirán antes que las moléculas más pequeñas.

En el contexto de la purificación de proteínas, el eluyente se suele agrupar en diferentes tubos de ensayo. Todos los tubos de ensayo que no contienen trazas mensurables de la proteína a purificar se descartan. La solución restante se compone de la proteína a purificar y otras proteínas de tamaño similar.

Una sola técnica cromatográfica basada en propiedades moleculares no suele ser suficiente para obtener una proteína de alta pureza. ^[1] Además del tamaño, la cromatografía de intercambio iónico separa los compuestos según la naturaleza y el grado de su carga iónica. La columna a utilizar se selecciona según su tipo y fuerza de carga. Las resinas de intercambio aniónico tienen una carga positiva y se utilizan para retener y separar compuestos con carga negativa (aniones), mientras que las resinas de intercambio catiónico tienen una carga negativa y se utilizan para separar moléculas con carga positiva (cationes).

Antes de que comience la separación, se bombea un tampón a través de la columna para equilibrar los iones con carga opuesta. Tras la inyección de la muestra, las moléculas de soluto se intercambiarán con los iones del tampón a medida que cada uno compite por los sitios de unión en la resina. La duración de la retención de cada soluto depende de la fuerza de su carga. Los compuestos con carga más débil se eluirán primero, seguidos de aquellos con cargas sucesivamente más fuertes. Debido a la naturaleza del mecanismo de separación, el pH, el tipo de tampón, la concentración del tampón y la temperatura desempeñan papeles importantes en el control de la separación.

La cromatografía de intercambio iónico es una herramienta muy poderosa para su uso en la purificación de proteínas y se utiliza con frecuencia en separaciones analíticas y preparativas.

La electroforesis de flujo libre (FFE) es una técnica de electroforesis sin portador que permite la separación preparativa de proteínas en una corriente de tampón laminar mediante el uso de un campo eléctrico ortogonal. Al hacer uso de un gradiente de pH, que puede ser inducido por anfolitos , por ejemplo , esta técnica permite separar isoformas de proteínas con una resolución de < 0,02 delta-pI.

El medio HIC es anfifílico, con regiones hidrofóbicas e hidrofílicas, lo que permite la separación de proteínas en función de su hidrofobicidad superficial. Las proteínas objetivo y las especies agregadas de sus productos tienden a tener diferentes propiedades hidrofóbicas y su eliminación mediante HIC purifica aún más la proteína de interés. ^[8] Además, el entorno utilizado suele emplear condiciones desnaturalizantes menos duras que otras técnicas de cromatografía, lo que ayuda a preservar la proteína de interés en su estado nativo y funcional. En agua pura, las interacciones entre la resina y las regiones hidrofóbicas de la proteína serían muy débiles, pero esta interacción se mejora al aplicar una muestra de proteína a la resina HIC en un tampón de alta fuerza iónica. Luego, la fuerza iónica del tampón se reduce para eluir las proteínas en orden de hidrofobicidad decreciente. ^[9]

La cromatografía de afinidad es otra técnica de separación potente que es altamente selectiva para la proteína de interés en función de la conformación molecular, y que con frecuencia utiliza resinas específicas para cada aplicación. Estas resinas tienen ligandos adheridos a sus superficies que son específicos para los compuestos que se van a separar. En la mayoría de los casos, estos ligandos funcionan de una manera similar a la de las interacciones anticuerpo-antígeno. Este ajuste de "llave y cerradura" entre el ligando y su compuesto objetivo lo hace altamente específico, generando con frecuencia un único pico, mientras que todo lo demás en la muestra no se retiene.

Muchas proteínas de membrana son glicoproteínas y pueden purificarse mediante cromatografía de afinidad con lectinas . Las proteínas solubilizadas con detergente pueden unirse a una resina cromatográfica que ha sido modificada para tener una lectina unida covalentemente. Las proteínas que no se unen a la lectina se eliminan por lavado y luego las glicoproteínas unidas específicamente pueden eluirse agregando una alta concentración de un azúcar que compite con las glicoproteínas unidas en el sitio de unión de la lectina. Algunas lectinas tienen una alta afinidad de unión a oligosacáridos de glicoproteínas que es difícil de competir con los azúcares, y las glicoproteínas unidas deben liberarse desnaturalizando la lectina.

La cromatografía de inmunoafinidad utiliza la unión específica de un anticuerpo -antígeno para purificar selectivamente la proteína diana. El procedimiento implica la inmovilización de una proteína a un sustrato sólido (por ejemplo, una perla porosa o una membrana), que luego se une selectivamente al objetivo, mientras que todo lo demás fluye a través de él. La proteína diana se puede eluir cambiando el pH o la salinidad . El ligando inmovilizado puede ser un anticuerpo (como la inmunoglobulina G ) o puede ser una proteína (como la proteína A ). Debido a que este método no implica la ingeniería de una etiqueta, se puede utilizar para proteínas de fuentes naturales. ^[10]

La cromatografía líquida de alto rendimiento o cromatografía líquida de alta presión es una forma de cromatografía que aplica alta presión para impulsar los solutos a través de la columna más rápido. Esto significa que la difusión es limitada y la resolución mejora. La forma más común es la HPLC de "fase reversa", donde el material de la columna es hidrófobo . Las proteínas se eluyen mediante un gradiente de cantidades crecientes de un disolvente orgánico , como acetonitrilo. Las proteínas eluyen de acuerdo con su hidrofobicidad. Después de la purificación por HPLC, la proteína está en una solución que solo contiene compuestos volátiles y se puede liofilizar fácilmente. ^[11] La purificación por HPLC con frecuencia da como resultado la desnaturalización de las proteínas purificadas y, por lo tanto, no es aplicable a las proteínas que no se repliegan espontáneamente.

Otra forma de etiquetar proteínas es diseñar una etiqueta de péptido antigénico en la proteína y luego purificar la proteína en una columna o incubándola con una resina suelta recubierta con un anticuerpo inmovilizado . Este procedimiento en particular se conoce como inmunoprecipitación . La inmunoprecipitación es capaz de generar una interacción extremadamente específica que generalmente da como resultado la unión solo de la proteína deseada. Las proteínas etiquetadas purificadas se pueden separar fácilmente de las otras proteínas en solución y luego eluir nuevamente en una solución limpia.

Cuando las etiquetas ya no son necesarias, se pueden escindir mediante una proteasa. Esto suele implicar la creación de un sitio de escisión entre la etiqueta y la proteína.

Cabe señalar que la etiqueta autoescindible elimina la necesidad de utilizar proteasas para separar la etiqueta de la proteína objetivo de interés durante el proceso de purificación ( por ejemplo , i CapTag™). ^{[12] [13]} El componente principal de la etiqueta es una inteína, que se escinde simplemente después del cambio de pH. Luego, la proteína objetivo pura y sin etiqueta se libera en el tampón de elución.

Al final de una purificación de proteínas, a menudo es necesario concentrarlas. Existen diferentes métodos.

Si la solución no contiene ningún otro componente soluble que la proteína en cuestión, la proteína se puede liofilizar (secar). Esto se hace habitualmente después de una ejecución de HPLC. Esto simplemente elimina todos los componentes volátiles, dejando atrás las proteínas.

La ultrafiltración concentra una solución de proteínas mediante membranas permeables selectivas. La función de la membrana es dejar pasar el agua y las moléculas pequeñas, pero reteniendo la proteína. La solución se empuja contra la membrana mediante una bomba mecánica, presión de gas o centrifugación.

El método más general para controlar el proceso de purificación es realizar una electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS de los diferentes pasos. Este método solo proporciona una medida aproximada de las cantidades de diferentes proteínas en la mezcla y no permite distinguir entre proteínas con un peso molecular aparente similar .

Si la proteína tiene una característica espectroscópica distintiva o una actividad enzimática , esta propiedad se puede utilizar para detectar y cuantificar la proteína específica y, por lo tanto, para seleccionar las fracciones de la separación que contienen la proteína. Si hay anticuerpos contra la proteína disponibles, entonces la inmunotransferencia y el ELISA pueden detectar y cuantificar específicamente la cantidad de proteína deseada. Algunas proteínas funcionan como receptores y se pueden detectar durante los pasos de purificación mediante un ensayo de unión de ligando , a menudo utilizando un ligando radiactivo .

Para evaluar el proceso de purificación de múltiples pasos, la cantidad de proteína específica debe compararse con la cantidad de proteína total. Esta última puede determinarse mediante el ensayo de proteína total de Bradford o mediante la absorbancia de luz a 280 nm , sin embargo, algunos reactivos utilizados durante el proceso de purificación pueden interferir con la cuantificación. Por ejemplo, el imidazol (comúnmente utilizado para la purificación de proteínas recombinantes marcadas con polihistidina) es un análogo de aminoácido y en bajas concentraciones interferirá con el ensayo de ácido bicinconínico (BCA) para la cuantificación de proteína total. Las impurezas en el imidazol de baja calidad también absorberán a 280 nm, lo que dará como resultado una lectura inexacta de la concentración de proteína a partir de la absorbancia UV.

Otro método que se debe tener en cuenta es la resonancia de plasmón superficial (SPR, por sus siglas en inglés). La SPR puede detectar la unión de moléculas sin etiqueta en la superficie de un chip. Si la proteína deseada es un anticuerpo, la unión se puede traducir directamente en la actividad de la proteína. Se puede expresar la concentración activa de la proteína como porcentaje de la proteína total. La SPR puede ser un método poderoso para determinar rápidamente la actividad de la proteína y el rendimiento general. Es una tecnología poderosa que requiere un instrumento para funcionar.

La electroforesis en gel es una técnica de laboratorio común que se puede utilizar tanto como método preparativo como analítico. El principio de la electroforesis se basa en el movimiento de un ion cargado en un campo eléctrico. En la práctica, las proteínas se desnaturalizan en una solución que contiene un detergente ( SDS ). En estas condiciones, las proteínas se desdoblan y se recubren con moléculas de detergente con carga negativa. Las proteínas en SDS-PAGE se separan únicamente en función de su tamaño.

En los métodos analíticos, la proteína migra en forma de bandas según su tamaño. Cada banda se puede detectar utilizando tinciones como el colorante azul de Coomassie o la tinción de plata . Los métodos preparativos para purificar grandes cantidades de proteína requieren la extracción de la proteína del gel electroforético. Esta extracción puede implicar la escisión del gel que contiene una banda o la elución de la banda directamente del gel a medida que se escurre por el extremo del gel.

En el contexto de una estrategia de purificación, la electroforesis en condiciones desnaturalizantes proporciona una resolución mejorada respecto de la cromatografía de exclusión por tamaño, pero no se adapta a grandes cantidades de proteínas en una muestra tan bien como las columnas de cromatografía tardía .

Un procedimiento electroforético no desnaturalizante para aislar metaloproteínas bioactivas en mezclas complejas de proteínas es la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) nativa preparativa . La integridad estructural de la proteína aislada debe confirmarse mediante un método independiente. ^[14]

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