Pinza de tensión

La pinza de voltaje es un método experimental utilizado por los electrofisiólogos para medir las corrientes de iones a través de las membranas de las células excitables, como las neuronas , mientras se mantiene el voltaje de la membrana en un nivel establecido. ^[1] Una pinza de voltaje básica medirá iterativamente el potencial de membrana y luego cambiará el potencial de membrana (voltaje) a un valor deseado agregando la corriente necesaria. Esto "sujeta" la membrana celular a un voltaje constante deseado, lo que permite que la pinza de voltaje registre qué corrientes se entregan. Debido a que las corrientes aplicadas a la célula deben ser iguales a (y opuestas en carga a) la corriente que atraviesa la membrana celular al voltaje establecido, las corrientes registradas indican cómo reacciona la célula a los cambios en el potencial de membrana. ^[2] Las membranas celulares de las células excitables contienen muchos tipos diferentes de canales iónicos , algunos de los cuales están controlados por voltaje . La pinza de voltaje permite manipular el voltaje de la membrana independientemente de las corrientes iónicas, lo que permite estudiar las relaciones corriente-voltaje de los canales de membrana. ^[3]

El concepto de pinza de tensión se atribuye a Kenneth Cole ^[4] y George Marmont ^[5] en la primavera de 1947. ^[6] Insertaron un electrodo interno en el axón gigante de un calamar y comenzaron a aplicar una corriente. Cole descubrió que era posible utilizar dos electrodos y un circuito de retroalimentación para mantener el potencial de membrana de la célula en un nivel establecido por el experimentador.

Cole desarrolló la técnica de fijación de voltaje antes de la era de los microelectrodos , por lo que sus dos electrodos consistían en cables finos retorcidos alrededor de una varilla aislante . Debido a que este tipo de electrodo podía insertarse solo en las células más grandes, los primeros experimentos electrofisiológicos se llevaron a cabo casi exclusivamente en axones de calamar .

Los calamares expulsan chorros de agua cuando necesitan moverse rápidamente, como cuando escapan de un depredador. Para que esta huida sea lo más rápida posible, tienen un axón que puede alcanzar 1 mm de diámetro (las señales se propagan más rápidamente por axones grandes). El axón gigante del calamar fue la primera preparación que se pudo utilizar para bloquear el voltaje de una corriente transmembrana, y fue la base de los experimentos pioneros de Hodgkin y Huxley sobre las propiedades del potencial de acción. ^[6]

Alan Hodgkin se dio cuenta de que, para comprender el flujo de iones a través de la membrana, era necesario eliminar las diferencias en el potencial de membrana. ^[7] Utilizando experimentos con pinzas de voltaje, Hodgkin y Andrew Huxley publicaron 5 artículos en el verano de 1952 describiendo cómo las corrientes iónicas dan lugar al potencial de acción . ^[8] El artículo final propuso el modelo de Hodgkin-Huxley que describe matemáticamente el potencial de acción. El uso de pinzas de voltaje en sus experimentos para estudiar y modelar el potencial de acción en detalle ha sentado las bases para la electrofisiología ; por la que compartieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 1963. ^[7]

La pinza de tensión es un generador de corriente. La tensión transmembrana se registra a través de un "electrodo de tensión", relativo a tierra , y un "electrodo de corriente" pasa corriente a la célula. El experimentador establece un "voltaje de mantenimiento", o "potencial de comando", y la pinza de tensión utiliza retroalimentación negativa para mantener la célula a este voltaje. Los electrodos están conectados a un amplificador, que mide el potencial de membrana y alimenta la señal a un amplificador de retroalimentación . Este amplificador también recibe una entrada del generador de señal que determina el potencial de comando, y resta el potencial de membrana del potencial de comando (V _comando – V _m ), magnifica cualquier diferencia y envía una salida al electrodo de corriente. Siempre que la célula se desvía del voltaje de mantenimiento, el amplificador operacional genera una "señal de error", que es la diferencia entre el potencial de comando y el voltaje real de la célula. El circuito de retroalimentación pasa corriente a la célula para reducir la señal de error a cero. Por lo tanto, el circuito de pinza produce una corriente igual y opuesta a la corriente iónica.

La técnica de pinzamiento de voltaje de dos electrodos (TEVC) se utiliza para estudiar las propiedades de las proteínas de membrana, especialmente los canales iónicos. ^[9] Los investigadores utilizan este método con mayor frecuencia para investigar las estructuras de membrana expresadas en los ovocitos de Xenopus . El gran tamaño de estos ovocitos permite una fácil manipulación. ^[10]

El método TEVC utiliza dos pipetas de baja resistencia, una que detecta el voltaje y la otra que inyecta la corriente. Los microelectrodos se llenan con una solución conductora y se insertan en la celda para controlar artificialmente el potencial de membrana. La membrana actúa como un dieléctrico y también como un resistor , mientras que los fluidos a cada lado de la membrana funcionan como capacitores . ^[10] Los microelectrodos comparan el potencial de membrana con un voltaje de comando, lo que proporciona una reproducción precisa de las corrientes que fluyen a través de la membrana. Las lecturas de corriente se pueden utilizar para analizar la respuesta eléctrica de la celda a diferentes aplicaciones.

Esta técnica se prefiere a la pinza de un solo microelectrodo u otras técnicas de pinza de voltaje cuando las condiciones exigen resolver grandes corrientes. La alta capacidad de paso de corriente de la pinza de dos electrodos permite sujetar grandes corrientes que son imposibles de controlar con técnicas de parche de un solo electrodo . ^[11] El sistema de dos electrodos también es deseable por su rápido tiempo de asentamiento de la pinza y bajo ruido. Sin embargo, el uso de TEVC es limitado con respecto al tamaño de la célula. Es eficaz en ovocitos de mayor diámetro, pero más difícil de usar con células pequeñas. Además, el método TEVC es limitado en que el transmisor de corriente debe estar contenido en la pipeta. No es posible manipular el fluido intracelular mientras se sujeta, lo que es posible utilizando técnicas de pinza de parche. ^[2] Otra desventaja implica problemas de "pinza espacial". La pinza de voltaje de Cole utilizó un cable largo que sujetaba el axón del calamar de manera uniforme a lo largo de toda su longitud. Los microelectrodos TEVC pueden proporcionar solo una fuente puntual espacial de corriente que puede no afectar uniformemente a todas las partes de una célula de forma irregular.

La técnica de pinzamiento de voltaje de doble celda es una variación especializada del pinzamiento de voltaje de dos electrodos, y solo se utiliza en el estudio de canales de unión gap . ^[12] Las uniones gap son poros que unen directamente dos células a través de los cuales fluyen libremente iones y moléculas pequeñas. Cuando se expresan dos células en las que se expresan proteínas de unión gap, típicamente conexinas o inexinas , ya sea de forma endógena o mediante inyección de ARNm , se formará un canal de unión entre las células. Dado que hay dos células presentes en el sistema, se utilizan dos juegos de electrodos. Se insertan un electrodo de registro y un electrodo de inyección de corriente en cada célula, y cada célula se pinza individualmente (cada juego de electrodos está conectado a un aparato separado, y la integración de datos se realiza por computadora). Para registrar la conductancia de unión , se varía la corriente en la primera celda mientras que el electrodo de registro en la segunda celda registra cualquier cambio en V _m solo para la segunda celda. (El proceso se puede revertir con el estímulo ocurriendo en la segunda celda y el registro ocurriendo en la primera celda.) Dado que el electrodo de la celda registrada no induce ninguna variación en la corriente, cualquier cambio en el voltaje debe ser inducido por la corriente que cruza hacia la celda registrada, a través de los canales de unión estrecha, desde la celda en la que se varió la corriente. ^[12]

Esta categoría describe un conjunto de técnicas en las que se utiliza un electrodo para la fijación de voltaje. La técnica de fijación continua de un solo electrodo (SEVC-c) se utiliza a menudo con el registro de fijación de parche. La técnica de fijación de voltaje de un solo electrodo discontinuo (SEVC-d) se utiliza con el registro intracelular penetrante. Este electrodo único realiza las funciones tanto de inyección de corriente como de registro de voltaje.

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La técnica de "patch-clamp" permite el estudio de canales iónicos individuales. Utiliza un electrodo con una punta relativamente grande (> 1 micrómetro) que tiene una superficie lisa (en lugar de una punta afilada). Se trata de un "electrodo de patch-clamp" (a diferencia de un "electrodo afilado" utilizado para atravesar células). Este electrodo se presiona contra una membrana celular y se aplica succión para tirar de la membrana de la célula hacia el interior de la punta del electrodo. La succión hace que la célula forme un sello hermético con el electrodo (un "sello de gigaohmio", ya que la resistencia es superior a un gigaohmio ).

La ventaja de SEV-c es que permite realizar grabaciones de células pequeñas que serían imposibles de atravesar con dos electrodos. Sin embargo:

1. Los microelectrodos son conductores imperfectos, por lo general tienen una resistencia de más de un millón de ohmios . Rectifican (es decir, cambian su resistencia con el voltaje, a menudo de manera irregular), a veces tienen una resistencia inestable si se obstruyen con el contenido de la celda. Por lo tanto, no registrarán fielmente el voltaje de la celda, especialmente cuando cambia rápidamente, ni tampoco pasarán la corriente fielmente.
2. Errores de voltaje y corriente: el circuito SEV-c en realidad no mide el voltaje de la celda que se está sujetando (como lo hace una pinza de dos electrodos). El amplificador de pinza de parche es como una pinza de dos electrodos, excepto que los circuitos de medición de voltaje y de paso de corriente están conectados (en la pinza de dos electrodos, están conectados a través de la celda ). El electrodo está conectado a un cable que hace contacto con el bucle de corriente/voltaje dentro del amplificador. Por lo tanto, el electrodo solo tiene una influencia indirecta en el circuito de retroalimentación. El amplificador lee solo el voltaje en la parte superior del electrodo y retroalimenta corriente para compensar. Pero, si el electrodo es un conductor imperfecto, el circuito de la pinza solo tiene una visión distorsionada del potencial de membrana. Del mismo modo, cuando el circuito pasa corriente de regreso para compensar ese voltaje (distorsionado), el electrodo distorsionará la corriente antes de que llegue a la celda. Para compensar esto, el electrofisiólogo utiliza el electrodo de menor resistencia posible, se asegura de que las características del electrodo no cambien durante un experimento (por lo que los errores serán constantes) y evita registrar corrientes con cinéticas que probablemente sean demasiado rápidas para que la pinza las siga con precisión. La precisión de SEV-c aumenta cuanto más lentos y pequeños sean los cambios de voltaje que intenta registrar.
3. Errores de resistencia en serie: Las corrientes que pasan a la celda deben ir a tierra para completar el circuito. Los voltajes son registrados por el amplificador en relación con la tierra. Cuando una celda está sujeta a su potencial de reposo natural , no hay problema; la pinza no está pasando corriente y el voltaje lo genera solo la celda. Pero, cuando se sujeta a un potencial diferente, los errores de resistencia en serie se vuelven una preocupación; la celda pasará corriente a través de su membrana en un intento de volver a su potencial de reposo natural. El amplificador de pinza se opone a esto al pasar corriente para mantener el potencial de retención. Surge un problema porque el electrodo está entre el amplificador y la celda; es decir, el electrodo está en serie con la resistencia que es la membrana de la celda. Por lo tanto, cuando pasa corriente a través del electrodo y la celda, la ley de Ohm nos dice que esto hará que se forme un voltaje a través de la resistencia de la celda y del electrodo. Como estas resistencias están en serie, las caídas de voltaje se sumarán. Si el electrodo y la membrana celular tienen resistencias iguales (lo que normalmente no ocurre), y si el experimentador ordena un cambio de 40 mV a partir del potencial de reposo, el amplificador pasará suficiente corriente hasta que lea que ha alcanzado ese cambio de 40 mV. Sin embargo, en este ejemplo, la mitad de esa caída de voltaje se produce a través del electrodo. El experimentador cree que ha movido el voltaje de la célula en 40 mV, pero lo ha movido sólo en 20 mV. La diferencia es el "error de resistencia en serie". Los amplificadores de fijación de parche modernos tienen circuitos para compensar este error, pero estos compensan sólo el 70-80% del mismo. El electrofisiólogo puede reducir aún más el error registrando en o cerca del potencial de reposo natural de la célula, y utilizando un electrodo de resistencia lo más baja posible.
4. Errores de capacitancia. Los microelectrodos son condensadores y son particularmente problemáticos porque no son lineales. La capacitancia surge porque el electrolito dentro del electrodo está separado por un aislante (vidrio) de la solución exterior. Esto es, por definición y función, un condensador. Peor aún, como el espesor del vidrio cambia cuanto más se aleja de la punta, la constante de tiempo del condensador variará. Esto produce un registro distorsionado del voltaje o la corriente de la membrana siempre que cambian. Los amplificadores pueden compensar esto, pero no por completo porque la capacitancia tiene muchas constantes de tiempo. El experimentador puede reducir el problema manteniendo la solución de baño de la celda poco profunda (exponiendo menos superficie de vidrio al líquido) y recubriendo el electrodo con silicona, resina, pintura u otra sustancia que aumente la distancia entre las soluciones interior y exterior.
5. Errores de fijación espacial. Un solo electrodo es una fuente puntual de corriente. En partes distantes de la célula, la corriente que pasa a través del electrodo tendrá menos influencia que en las partes cercanas de la célula. Esto es particularmente un problema cuando se registran neuronas con estructuras dendríticas elaboradas. No hay nada que se pueda hacer con los errores de fijación espacial excepto moderar las conclusiones del experimento.

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Un dispositivo de pinza de tensión de un solo electrodo discontinuo, o SEVC-d, tiene algunas ventajas sobre el SEVC-c para el registro de células completas. En este caso, se adopta un enfoque diferente para pasar corriente y registrar tensión. Un amplificador SEVC-d funciona sobre una base de " tiempo compartido ", por lo que el electrodo cambia de forma regular y frecuente entre el paso de corriente y la medición de tensión. En efecto, hay dos electrodos, pero cada uno está en funcionamiento sólo la mitad del tiempo que está encendido. La oscilación entre las dos funciones del electrodo único se denomina ciclo de trabajo. Durante cada ciclo, el amplificador mide el potencial de membrana y lo compara con el potencial de mantenimiento. Un amplificador operacional mide la diferencia y genera una señal de error. Esta corriente es una imagen especular de la corriente generada por la célula. Las salidas del amplificador cuentan con circuitos de muestreo y retención , por lo que cada tensión muestreada brevemente se mantiene en la salida hasta la siguiente medición en el siguiente ciclo. Para ser más específicos, el amplificador mide la tensión en los primeros microsegundos del ciclo, genera la señal de error y pasa el resto del ciclo pasando corriente para reducir ese error. Al comienzo del siguiente ciclo, se mide nuevamente el voltaje, se genera una nueva señal de error, pasa corriente, etc. El experimentador establece la duración del ciclo y es posible realizar muestreos con períodos tan bajos como aproximadamente 15 microsegundos, lo que corresponde a una frecuencia de conmutación de 67 kHz. Las frecuencias de conmutación inferiores a aproximadamente 10 kHz no son suficientes cuando se trabaja con potenciales de acción de menos de 1 milisegundo de ancho. Tenga en cuenta que no todos los amplificadores de fijación de voltaje discontinuos admiten frecuencias de conmutación superiores a 10 kHz. ^[10]

Para que esto funcione, la capacitancia de la celda debe ser mayor que la capacitancia del electrodo por al menos un orden de magnitud . La capacitancia ralentiza la cinética (los tiempos de subida y bajada) de las corrientes. Si la capacitancia del electrodo es mucho menor que la de la celda, entonces cuando la corriente pasa a través del electrodo, el voltaje del electrodo cambiará más rápido que el voltaje de la celda. Por lo tanto, cuando se inyecta corriente y luego se apaga (al final de un ciclo de trabajo), el voltaje del electrodo decaerá más rápido que el voltaje de la celda. Tan pronto como el voltaje del electrodo se asintóticamente al voltaje de la celda, el voltaje se puede muestrear (nuevamente) y aplicar la siguiente cantidad de carga. Por lo tanto, la frecuencia del ciclo de trabajo está limitada a la velocidad a la que el voltaje del electrodo aumenta y decae mientras pasa corriente. Cuanto menor sea la capacitancia del electrodo, más rápido se puede ciclar.

El SEVC-d tiene una gran ventaja sobre el SEVC-c, ya que permite al experimentador medir el potencial de membrana y, como evita el paso de corriente y la medición de voltaje al mismo tiempo, nunca hay un error de resistencia en serie. Las principales desventajas son que la resolución temporal es limitada y el amplificador es inestable. Si pasa demasiada corriente, de modo que se sobrepasa el voltaje objetivo, invierte la polaridad de la corriente en el siguiente ciclo de trabajo. Esto hace que no alcance el voltaje objetivo, por lo que el siguiente ciclo invierte nuevamente la polaridad de la corriente inyectada. Este error puede aumentar con cada ciclo hasta que el amplificador oscile sin control ("timbre"); esto generalmente resulta en la destrucción de la célula que se está registrando. El investigador desea un ciclo de trabajo corto para mejorar la resolución temporal; el amplificador tiene compensadores ajustables que harán que el voltaje del electrodo decaiga más rápido, pero, si estos se configuran demasiado altos, el amplificador timbrará, por lo que el investigador siempre está tratando de "afinar" el amplificador lo más cerca posible del borde de la oscilación descontrolada, en cuyo caso pequeños cambios en las condiciones de registro pueden causar timbre. Hay dos soluciones: “reducir” la configuración del amplificador a un rango seguro o estar alerta a las señales de que el amplificador está a punto de sonar.

Desde el punto de vista de la teoría de control , el experimento de fijación de voltaje se puede describir en términos de la aplicación de una ley de control de retroalimentación de salida de alta ganancia ^[13] a la membrana neuronal. ^[14] Matemáticamente, el voltaje de membrana se puede modelar mediante un modelo basado en conductancia con una entrada dada por la corriente aplicada y una salida dada por el voltaje de membrana . El modelo original basado en conductancia de Hodgkin y Huxley, que representa una membrana neuronal que contiene corrientes de iones de sodio y potasio , así como una corriente de fuga , está dado por el sistema de ecuaciones diferenciales ordinarias.${\displaystyle I_{app}(t)}$${\displaystyle V(t)}$

${\displaystyle C_{m}{\frac {dV}{dt}}=-{\bar {g}}_{\text{K}}n^{4}(V-V_{\text{K}})-{\bar {g}}_{\text{Na}}m^{3}h(V-V_{\text{Na}})-{\bar {g}}_{\text{L}}(V-V_{L})+I_{app}}$

${\displaystyle {\frac {dp}{dt}}=\alpha _{p}(V)(1-p)-\beta _{p}(V)p,\quad p=m,n,h}$

donde es la capacitancia de la membrana, , y son conductancias máximas, , y son potenciales de inversión, y son constantes de velocidad dependientes del voltaje del canal iónico, y las variables de estado , , y son variables de activación del canal iónico .${\displaystyle C_{m}}$${\displaystyle {\bar {g}}_{\text{Na}}}$${\displaystyle {\bar {g}}_{\text{K}}}$${\displaystyle {\bar {g}}_{\text{L}}}$${\displaystyle V_{\text{Na}}}$${\displaystyle V_{\text{K}}}$${\displaystyle V_{\text{L}}}$${\displaystyle \alpha _{p}}$${\displaystyle \beta _{p}}$${\displaystyle m}$${\displaystyle h}$${\displaystyle n}$

Es posible demostrar rigurosamente que la ley de retroalimentación

${\displaystyle I_{app}(t)=k(V_{\text{ref}}-V(t))}$

impulsa el voltaje de la membrana de forma arbitraria cerca del voltaje de referencia a medida que la ganancia aumenta a un valor arbitrariamente grande. ^[14] Este hecho, que de ninguna manera es una propiedad general de los sistemas dinámicos (una ganancia alta puede, en general, conducir a la inestabilidad ^[15] ), es una consecuencia de la estructura y las propiedades del modelo basado en conductancia anterior. En particular, la dinámica de cada variable de compuerta , que está impulsada por , verifica la fuerte propiedad de estabilidad de la contracción exponencial. ^{[14] [16]}${\displaystyle V(t)}$${\displaystyle V_{\text{ref}}}$${\displaystyle k>0}$${\displaystyle p=m,h,n}$${\displaystyle V}$

• Sherman-Gold R, ed. (1993). "Bioelectricidad" (PDF) . Guía de Axon para técnicas de laboratorio de electrofisiología y biofísica . Axon Instruments. págs. 1–16. OCLC  248830666.