Microscopía electrónica criogénica

Se ha sugerido que la criomicroscopía electrónica de transmisión se fusione en este artículo. ( Discutir ) Propuesto desde julio de 2024.

La microscopía electrónica criogénica ( crio-EM ) es una técnica de criomicroscopía aplicada a muestras enfriadas a temperaturas criogénicas . En el caso de las muestras biológicas, la estructura se preserva mediante su inclusión en un entorno de hielo vítreo . Se aplica una solución acuosa de muestra a una malla de rejilla y se congela por inmersión en etano líquido o una mezcla de etano líquido y propano . ^[1] Si bien el desarrollo de la técnica comenzó en la década de 1970, los avances recientes en tecnología de detectores y algoritmos de software han permitido la determinación de estructuras biomoleculares con una resolución cercana a la atómica. ^[2] Esto ha atraído una amplia atención al enfoque como una alternativa a la cristalografía de rayos X o la espectroscopia de RMN para la determinación de la estructura macromolecular sin la necesidad de cristalización. ^[3]

En 2017, el Premio Nobel de Química fue otorgado a Jacques Dubochet , Joachim Frank y Richard Henderson "por desarrollar la criomicroscopía electrónica para la determinación de la estructura de alta resolución de biomoléculas en solución". ^[4] Nature Methods también nombró a la criomicroscopía electrónica como el "Método del año" en 2015. ^[5]

En la década de 1960, el uso de la microscopía electrónica de transmisión para los métodos de determinación de la estructura era limitado debido al daño por radiación causado por los haces de electrones de alta energía. Los científicos plantearon la hipótesis de que examinar las muestras a bajas temperaturas reduciría el daño por radiación inducido por el haz. ^[6] Tanto el helio líquido (−269  °C o 4  K o −452,2  °F ) como el nitrógeno líquido (−195,79 °C o 77 K o −320 °F) se consideraban criógenos. En 1980, Erwin Knapek y Jacques Dubochet publicaron comentarios sobre el daño por haz a temperaturas criogénicas y compartieron las siguientes observaciones:

Se descubrió que los cristales delgados montados sobre una película de carbono eran entre 30 y 300 veces más resistentes al haz a 4 K que a temperatura ambiente... La mayoría de nuestros resultados se pueden explicar asumiendo que la crioprotección en la región de 4 K depende en gran medida de la temperatura. ^[7]

Sin embargo, estos resultados no fueron reproducibles y se publicaron correcciones en Nature solo dos años después informando que la resistencia del haz era menos significativa de lo que se había previsto inicialmente. La protección obtenida a 4 K era más cercana a "diez veces para muestras estándar de L- valina ", ^[8] de lo que se había indicado anteriormente.

En 1981, Alasdair McDowall y Jacques Dubochet, científicos del Laboratorio Europeo de Biología Molecular , informaron sobre la primera implementación exitosa de crio-EM. ^[9] McDowall y Dubochet vitrificaron agua pura en una película delgada rociándola sobre una película de carbono hidrófilo que se sumergió rápidamente en criógeno ( propano líquido o etano líquido enfriado a 77 K). La capa delgada de hielo amorfo tenía menos de 1 μm de espesor y un patrón de difracción de electrones confirmó la presencia de hielo amorfo/vítreo. En 1984, el grupo de Dubochet demostró el poder de la crio-EM en biología estructural con el análisis del adenovirus tipo 2 vitrificado , el bacteriófago T4 , el virus del bosque Semliki , el bacteriófago CbK y el virus de la estomatitis vesicular . ^[10]

La década de 2010 estuvo marcada por avances drásticos en las cámaras electrónicas. En particular, las mejoras realizadas en los detectores directos de electrones han llevado a una "revolución de la resolución" ^[11], que ha empujado la barrera de la resolución por debajo del límite crucial de ~2-3 Å para determinar la posición y la orientación de los aminoácidos. ^[12]

Henderson ( MRC Laboratory of Molecular Biology , Cambridge, Reino Unido) formó un consorcio con ingenieros del Rutherford Appleton Laboratory y científicos de la Max Planck Society para financiar y desarrollar un primer prototipo. Luego, el consorcio unió fuerzas con el fabricante de microscopios electrónicos FEI para lanzar y comercializar el nuevo diseño. Casi al mismo tiempo, Gatan Inc. de Pleasanton, California, presentó un detector similar diseñado por Peter Denes ( Lawrence Berkeley National Laboratory ) y David Agard ( University of California, San Francisco ). Nguyen-Huu Xuong desarrolló un tercer tipo de cámara en la empresa Direct Electron ( San Diego, California ). ^[11]

Más recientemente, los avances en el uso de estructuras de imágenes basadas en proteínas están ayudando a resolver los problemas de sesgo de orientación de la muestra y límite de tamaño. Las proteínas más pequeñas de ~50 kDa generalmente tienen una relación señal-ruido (SNR) demasiado baja para poder resolver partículas de proteína en la imagen, lo que hace que la reconstrucción 3D sea difícil o imposible. ^[13] La SNR de proteínas más pequeñas se puede mejorar uniéndolas a una estructura de imágenes. El grupo de Yeates en UCLA pudo crear una imagen más clara de tres variantes de KRAS (aproximadamente de 19 kDa de tamaño) utilizando una estructura de imágenes rígida y usando DARPins como dominios de unión modulares entre la estructura y la proteína de interés. ^[14]

En reconocimiento al impacto que la crio-EM ha tenido en la bioquímica, tres científicos, Jacques Dubochet , Joachim Frank y Richard Henderson , recibieron el Premio Nobel de Química "por desarrollar la microscopía crioelectrónica para la determinación de la estructura de alta resolución de biomoléculas en solución". ^[4]

Tradicionalmente, la cristalografía de rayos X ha sido la técnica más popular para determinar las estructuras 3D de las moléculas biológicas. ^[15] Sin embargo, las mejoras mencionadas anteriormente en crio-EM han aumentado su popularidad como herramienta para examinar los detalles de las moléculas biológicas. Desde 2010, los depósitos anuales de estructuras crio-EM han superado a la cristalografía de rayos X. ^[16] Aunque la cristalografía de rayos X tiene drásticamente más depósitos totales debido a una historia de décadas más larga, se proyecta que los depósitos totales de los dos métodos eclipsarán alrededor de 2035. ^[16]

La resolución de la cristalografía de rayos X está limitada por la homogeneidad de los cristales ^[17], y lograr que moléculas biológicas con condiciones de cristalización ideales desconocidas alcancen un estado cristalino puede llevar mucho tiempo, y en casos extremos puede llevar meses o incluso años ^[18] . Por el contrario, la preparación de muestras en crio-EM puede requerir varias rondas de selección y optimización para superar problemas como la agregación de proteínas y las orientaciones preferidas ^{[19] [20]} , pero no requiere que la muestra forme un cristal, sino que las muestras para crio-EM se congelan instantáneamente y se examinan en sus estados casi nativos ^{[21] .}

Según Proteopedia , la resolución media alcanzada por cristalografía de rayos X (al 19 de mayo de 2019) en el Protein Data Bank es de 2,05 Å , ^[17] y la resolución más alta alcanzada registrada (al 30 de septiembre de 2022) es de 0,48 Å. ^[22] A partir de 2020, la mayoría de las estructuras de proteínas determinadas por crio-EM tienen una resolución más baja de 3-4 Å. ^[23] Sin embargo, a partir de 2020, la mejor resolución crio-EM se ha registrado en 1,22 Å, ^[20] lo que la convierte en un competidor en resolución en algunos casos.

En 2019, se utilizaron técnicas correlativas de crio-TEM y crio-ET para observar nanotubos de efecto túnel (TNT) en células neuronales. ^[24]

La criomicroscopía electrónica de barrido (cryoSEM) es una técnica de microscopía electrónica de barrido que utiliza la platina fría de un microscopio electrónico de barrido en una cámara criogénica.

La microscopía electrónica de transmisión criogénica (crio-TEM) es una técnica de microscopía electrónica de transmisión que se utiliza en biología estructural y ciencia de los materiales . Coloquialmente, el término "microscopía electrónica criogénica" o su abreviatura "crio-EM" se refiere a la microscopía electrónica de transmisión criogénica por defecto, ya que la gran mayoría de la crio-EM se realiza en microscopios electrónicos de transmisión, en lugar de microscopios electrónicos de barrido.

A finales de noviembre de 2021, el Instituto Federal de Tecnología , la Universidad de Lausana y la Universidad de Ginebra inauguraron el Centro Dubochet de Imagenología (DCI) con el fin de aplicar y seguir desarrollando la crio-EM. ^[25] Menos de un mes después de la primera identificación de la variante ómicron del SARS-CoV-2 , los investigadores del DCI pudieron definir su estructura, identificar las mutaciones cruciales para eludir las vacunas individuales y aportar información para nuevos enfoques terapéuticos. ^[26]

La Instalación Crio-EM Nacional Danesa, también conocida como EMBION, se inauguró el 1 de diciembre de 2016. EMBION es un consorcio de crio-EM entre universidades danesas (la Universidad de Aarhus es la anfitriona y la Universidad de Copenhague la coanfitriona).

• Tomografía electrónica criogénica (crio-ET), una aplicación especializada en la que se toman muchas imágenes de muestras individuales en varios ángulos de inclinación, lo que da como resultado una reconstrucción 3D de una sola muestra. ^[27]
• Cristalografía electrónica , método para determinar la disposición de los átomos en sólidos utilizando un TEM
• MicroED , ^[28] método para determinar la estructura de proteínas , péptidos , moléculas orgánicas y compuestos inorgánicos utilizando difracción de electrones de cristales 3D ^{[29] [30] [31]}
• Análisis de partículas individuales mediante crio-EM, un método de promediado para determinar la estructura de proteínas a partir de muestras monodispersas. ^[32]

• 
  Imagen crio-EM de GroEL suspendida en hielo amorfo enAumento de 50 000 ×
• Estructura de la alcohol oxidasa de Pichia pastoris mediante crio-microscopía electrónica
• 
  Imagen crio-EM de una célula ARMAN intacta de una biopelícula de Iron Mountain. El ancho de la imagen es de 576 nm.
• 
  Imagen crio-EM del virus marino gigante CroV
  (la barra de escala representa 200 nm) ^[33]

• Criofijación
• Biocristalografía criogénica
• Tomografía electrónica (TE)