Citometría de flujo fotoacústica

La citometría de flujo fotoacústica o PAFC es una modalidad de obtención de imágenes biomédicas que utiliza imágenes fotoacústicas para realizar la citometría de flujo . Un flujo de células pasa por un sistema fotoacústico que produce una respuesta de señal individual. Cada señal se cuenta para producir una evaluación cuantitativa de la muestra de entrada.

La citometría de flujo tradicional utiliza células en una corriente laminar de un solo archivo que luego pasa a través de una fuente de luz. El uso de diversas cuantificaciones de la dispersión de la luz de las células permite al sistema cuantificar el tamaño y la complejidad celular, que en última instancia se pueden devolver en una cuantificación de la composición celular dentro de una muestra. La citometría de flujo fotoacústica funciona con principios similares, pero utiliza una señal fotoacústica para diferenciar los patrones celulares. Además, la citometría de flujo proporciona un gran análisis ex vivo , pero debido a su fuente óptica pura, su profundidad de penetración es limitada, lo que hace que el análisis in vivo sea limitado. Alternativamente, la fotoacústica puede proporcionar una ventaja sobre la citometría de flujo, ya que recibe una señal acústica en lugar de una óptica y puede penetrar a mayores profundidades, como se analiza más adelante en los principios operativos y las matemáticas.

El efecto fotoacústico (PA) fue descubierto por Alexander Bell en 1880 y se produce cuando una fuente de fotones es absorbida por una sustancia ópticamente receptiva que produce una onda ultrasónica. ^[1] La fuerza de la onda ultrasónica producida es una función de la intensidad del fotón absorbido y de las propiedades innatas de la sustancia iluminada. ^[2] Cada sustancia de interés absorbe fotones a una longitud de onda específica, por lo que solo ciertas sustancias producirán de forma innata una señal PA a una longitud de onda determinada. Por ejemplo, la hemoglobina y la melanina son dos sustancias biológicas comunes que producen fuertes señales PA en respuesta a pulsos láser en el rango de longitud de onda de 680 nm. ^[3] El espectro de absorción para el PA se encuentra dentro del espectro electromagnético visible, lo que hace que la obtención de imágenes PA no sea radiactiva por naturaleza. El espectro de absorción específico puede ser tanto una limitación como una explotación de la obtención de imágenes PA (consulte más información en aplicaciones).

Los sistemas utilizan comúnmente un sistema láser Nd:YAG (granate de itrio y aluminio dopado con neodimio) o LED que se pulsa para penetrar el tejido biológico de interés. ^{[4] [5]} Con cada pulso que entra en contacto con el tejido, se produce una señal PA en forma de onda de ultrasonido. Esta onda de ultrasonido se propaga a través del tejido hasta que llega a un transductor de ultrasonido para producir una línea A. Se extrae la amplitud máxima de cada línea A y su valor se traza en un gráfico de tiempo vs amplitud produciendo un gráfico de citometría.

La citometría de flujo fotoacústica funciona según el principio del efecto fotoacústico, según el cual un láser en el espectro visible produce un aumento de temperatura y, por lo tanto, una expansión térmica. A continuación se describe la ecuación de expansión térmica en relación con la intensidad del láser para un láser pulsante. ^[2]

${\displaystyle H(z,t)=\mu _{a}I_{0}e^{-\omega t}}$

Donde es el coeficiente de absorción de la ecuación enfocada, es la intensidad del láser, ⍵ es la frecuencia del pulso láser, t es el tiempo. se describe como la expresión exponencial de una función sinusoidal determinada por la fórmula de Euler . Es importante señalar que la profundidad de penetración del láser está limitada por el régimen difusivo, que depende de la atenuación a través del tejido antes del objetivo biológico a irradiar.${\displaystyle \mu_{a}}$${\displaystyle I_{0}}$${\displaystyle e^{-i\omega t}}$

A continuación se establece la relación calor-presión para una señal fotoacústica. ^[2]

${\displaystyle [\nabla ^{2}-{1 \sobre \nu _{s}}{\parcial \sobre \parcial t^{2}}]p(z,t)=-{\beta \sobre C_{p}}{\parcial H \sobre \parcial t}}$

Donde ∇ es el conjunto de ecuaciones diferenciales parciales con relación espacial, es la velocidad del sonido en la sustancia de interés, t es el tiempo, es la presión en función del tiempo y del espacio, β es el coeficiente de expansión térmica, es la capacidad calorífica específica y es la diferencial parcial de la ecuación de calor descrita anteriormente.${\displaystyle \nu_{s}}$${\estilo de visualización p(z,t)}$${\displaystyle C_{p}}$${\displaystyle {\partial H \over \partial t}}$

El lado izquierdo de la ecuación describe la ecuación de onda de presión que se deriva para modelar una ecuación de onda de presión ultrasónica . El lado derecho de la ecuación determina la relación entre la producción de calor y la expansión térmica que da como resultado una onda de presión.

Si bien la realidad produce una onda tridimensional que se propaga a través del tejido, para los fines del PAFC, la información necesaria solo corresponde a un análisis unidimensional. A continuación se muestra la solución unidimensional gracias a un láser pulsado. ^[2]

${\displaystyle p(z,t)={\mu _{a}\beta F\nu _{s}^{2} \over 2C_{p}}{\hat {h}}(z,t)}$

Donde es el coeficiente de absorción, es el coeficiente de expansión térmica, es el calor específico, F es la fluencia del láser, es la velocidad del sonido en un material dado y es la energía total derivada del pulso láser.${\displaystyle \mu _{a}}$${\displaystyle C_{p}}$${\displaystyle \nu _{s}}$${\displaystyle {\hat {h}}(z,t)}$

Es importante señalar que, en el caso de exposiciones prolongadas al láser, la ecuación de onda se convierte en gran medida en una función de la intensidad del láser. Para analizar la señal de PA, el pulso láser debe ser breve en el tiempo para producir una señal cuyo valor varíe en función de las propiedades de la sustancia irradiada para diferenciar los objetivos de interés. Las diferencias en la onda de presión producida son la base para la separación de señales en PAFC.

La onda de presión creada tiene la forma de una onda ultrasónica. La onda se propaga a través del material y es detectada por un transductor ultrasónico. La presión se detecta mediante cristales piezoeléctricos que convierten la presión en un cambio de voltaje, es decir, la amplitud de la señal es proporcional al valor de la presión en un momento dado. Este voltaje se representa gráficamente en función del tiempo y da como resultado la formación de una línea A descrita anteriormente.

Los datos temporales son importantes para otros tipos de imágenes fotoacústicas, pero para los fines de PAFC, la amplitud máxima dentro de una línea A se extrae como punto de datos. Para cada pulso láser, este valor de amplitud máxima se representa gráficamente en función del tiempo, lo que produce un trazado de señal de citometría de flujo. Cada línea representa un pulso láser y su amplitud refleja el objetivo irradiado. Al seleccionar un rango de amplitud que sea representativo de un tipo de célula en particular, se pueden contar las señales y, por lo tanto, cuantificar los tipos de células dentro de una muestra determinada. La Figura 1 muestra una animación de células que fluyen y su trazado de señal PAFC representativo.

En los Estados Unidos se producen anualmente más de dos millones de infecciones bacterianas. ^[6] Con el aumento de la resistencia a los antibióticos, el tratamiento de estas infecciones se está volviendo cada vez más difícil, por lo que la selección correcta de antibióticos es cada vez más importante. La selección óptima de antibióticos depende de la capacidad de determinar las bacterias responsables. Tradicionalmente, la especiación bacteriana se determina mediante tecnologías de cultivo y PCR . Estas tecnologías tardan al menos 48 horas y, a veces, más. Debido al prolongado período de tiempo para la especiación, los proveedores deben seleccionar antibióticos de amplio espectro. La PAFC se puede utilizar para detectar bacterias en la sangre para una selección más oportuna de antibióticos.

El primer paso en la detección con PAFC es marcar las bacterias para que tengan una señal de PA para detectar. Por lo general, esto se compone de un tinte y un método para unir el tinte a las bacterias de interés. Aunque se han utilizado anticuerpos en el pasado, los bacteriófagos han demostrado ser más baratos y más estables de producir. ^[7] Múltiples estudios han demostrado la especificidad de la selección de bacteriófagos para una bacteria de interés, particularmente MRSA , E. Coli y Salmonella . ^{[8] [7] [9]} Los tintes varían, pero los más utilizados son las nanopartículas de oro , el verde de indocianina (ICG) y el tinte rojo 81. ^{[7] [9]} Los tintes producen una señal mejorada para permitir una detección más sensible. Los límites de detección encontrados en un estudio mostraron aproximadamente 1 célula bacteriana por 0,6 μm ³ . ^[9] Se han probado tintes específicos en animales para determinar su toxicidad y no han provocado ningún daño claro. Aunque aún no se han realizado estudios en humanos para la detección de bacterias en la sangre, el PAFC puede desempeñar un papel en futuras aplicaciones de detección de bacterias.

La malaria causa la muerte de 0,4 millones de personas al año en todo el mundo. ^[10] Con los medicamentos actuales, la detección temprana es clave para prevenir estas muertes. Los métodos actuales incluyen la detección microscópica en frotis de sangre , serología o PCR. ^[11] Los técnicos de laboratorio pueden carecer de la experiencia o las tecnologías pueden ser demasiado caras para ciertas instalaciones, lo que inevitablemente pasa por alto el diagnóstico. Además, los métodos actuales generalmente no pueden detectar la malaria en parásitos < 50 por microlitro y necesitan 3-4 días después de la infección antes de que pueda ocurrir la detección. ^[12] Por lo tanto, existe la necesidad de un método de detección más automatizado y sensible para mejorar los resultados de los pacientes.

El PAFC ha demostrado tener límites de detección mucho más bajos que los métodos actuales. Un estudio demostró una sensibilidad de un parásito en 0,16 ml de sangre circulante y, por lo tanto, se puede detectar el día 1 o 2 después de la inoculación. ^[12] Además, los estudios han demostrado la viabilidad de la detección in vivo eliminando la posibilidad de diagnóstico erróneo a partir de células dañadas de la extracción de sangre y el análisis in vitro . ^[13] El PAFC detecta la malaria a través del marcador sustituto hemozoína, un producto de degradación producido por la malaria en la etapa de merozoito . La hemozoína es un gran objetivo fotoacústico y responde fuertemente en longitudes de onda de 671 nm y 820 nm. ^[12] Aunque las señales de fondo son producidas por la hemoglobina dentro de los glóbulos rojos , los glóbulos rojos infectados (iRBC) con hemozoína producen una señal fuerte por encima de la hemoglobina en estas longitudes de onda. Los métodos in vitro utilizan tubos capilares de 50 micrómetros con un flujo de 1 cm/s (in vitro) para la detección. Por el contrario, Menyaev et al. demostraron la detección de la malaria in vivo. ^[13] La detección se realizó en vasos superficiales y profundos de ratones. Los vasos superficiales proporcionan una relación señal-ruido (SNR) más alta, pero son menos comparables a la de los vasos humanos. Las venas yugulares y las arterias carótidas de los ratones son similares en tamaño a los vasos humanos pequeños que demostraron mayores artefactos debido a la pulsación sanguínea y la variación respiratoria, pero podrían explicarse.

Aunque el PAFC proporciona un límite de detección más sensible, este método tiene algunas limitaciones. Como se mencionó anteriormente, la detección de hemozoína solo ocurre cuando los parásitos están en la etapa de merozoíto. Esto limita el marco de tiempo de detección de los parásitos en comparación con la detección en la etapa de trofozoíto , pero aún proporciona una detección más temprana que los métodos actuales. En segundo lugar, los tamaños de vasos probados hasta ahora solo se han realizado en ratones. Los artefactos del análisis de vasos más profundos en humanos pueden disminuir la sensibilidad del PAFC, lo que hace que el límite de detección sea menos útil de lo que se sugiere actualmente. Aunque aún existen desafíos, el PAFC puede desempeñar un papel en la mejora del diagnóstico de malaria en humanos.

Las células tumorales circulantes o CTC son células tumorales que se han desprendido de su tumor primario y viajan en la sangre. Estas CTC luego siembran sitios distantes dando lugar a metástasis . Las metástasis causan el 90% de las muertes relacionadas con el cáncer y, como tal, la detección de CTC es fundamental para la prevención de metástasis. ^[14] Los estudios han demostrado que la detección temprana de CTC mejora el tratamiento y, por lo tanto, los tiempos de supervivencia más largos. (15) Los métodos de detección actuales incluyen RT-PCR , citometría de flujo, detección óptica, filtración de tamaño celular, entre otros. ^[14] Estos métodos son limitados debido al tamaño de la muestra de sangre extraída (~5–10 mL) que da como resultado un límite de detección de CTC de ~10 CTC/mL. Estos métodos tardan horas o días en obtener resultados, lo que puede provocar un retraso en el inicio del tratamiento.

La PAFC puede desempeñar un papel en la detección futura de CTC. Para evitar la limitación de la toma de muestras de pequeño volumen mediante la extracción de sangre del paciente, la PAFC utiliza un método in vivo para controlar un volumen de sangre mayor (es decir, el volumen completo). ^[15] El estudio demostró que al controlar la aorta de un ratón, pudieron visualizar todo el volumen de sangre del ratón en el plazo de 1 minuto desde la detección.

Las CTC, como los melanomas, contienen un cromóforo intrínseco y no requieren marcaje para su detección por encima del fondo de hemoglobina. Otras células tumorales (como las células escamosas cancerosas) pueden marcarse con nanopartículas para producir una señal de PA más grande que los glóbulos rojos para su detección. Estos métodos dieron como resultado un límite de detección mejorado de las CTC. De la Zerda et al. detectaron CTC después de solo 4 días con la inoculación de las células cancerosas. ^[14] Su límite de detección se determinó en 1 CTC/mL, una mejora de 10 veces en la sensibilidad. Además, se descubrió que el marcaje con nanopartículas no era tóxico y solo tomó 10 minutos para marcar de manera óptima las CTC. ^[14]

Esta detección de CTC se puede utilizar para la detección de metástasis, pero también tiene implicaciones terapéuticas. Durante la resección o manipulación del tumor se ha determinado que estas manipulaciones liberan CTC. La PAFC se puede utilizar como una forma de controlar la liberación de estas CTC que luego pueden requerir un tratamiento de manera sistemática. Debido al efecto termoelástico no lineal del láser sobre las CTC/nanopartículas, una mayor fluencia del láser puede hacer que las CTC se rompan sin dañar los glóbulos rojos locales. ^[16] Con la reducción de las CTC, esto podría mejorar el tratamiento con métodos sistémicos o eliminar por completo la necesidad.

Aunque existe un gran potencial de aplicación, todavía hay áreas que se pueden mejorar. En primer lugar, la PAFC tiene una profundidad limitada y solo se ha probado en la piel superficial de humanos, lo que puede suponer una dificultad para los tumores de localización más central, como los de pulmón o intestino. En segundo lugar, aunque los modelos de ratón iniciales han demostrado eficacia con el marcaje con nanopartículas, es necesario estudiar más a fondo el marcaje de tipos específicos de cáncer y los efectos secundarios de los colorantes para garantizar la seguridad de esta modalidad de obtención de imágenes.