Enlace isopeptídico

Un enlace isopeptídico es un tipo de enlace amida formado entre un grupo carboxilo de un aminoácido y un grupo amino de otro. Un enlace isopeptídico es la unión entre el grupo amino o carboxilo de la cadena lateral de un aminoácido al grupo α-carboxilo, α-amino o la cadena lateral de otro aminoácido. En un enlace peptídico típico , también conocido como enlace eupeptídico, el enlace amida siempre se forma entre el grupo α-carboxilo de un aminoácido y el grupo α-amino del segundo aminoácido. Los enlaces isopeptídicos son más raros que los enlaces peptídicos regulares. ^[1] Los enlaces isopeptídicos conducen a la ramificación en la secuencia primaria de una proteína. Las proteínas formadas a partir de enlaces peptídicos normales suelen tener una secuencia primaria lineal .

Los enlaces amida, y por lo tanto los enlaces isopeptídicos, se estabilizan por resonancia ( deslocalización electrónica ) entre el oxígeno del carbonilo , el carbono del carbonilo y el átomo de nitrógeno . La fuerza de enlace de un enlace isopeptídico es similar a la de un péptido debido al tipo de enlace similar. La fuerza de enlace de un enlace peptídico es de alrededor de 300 kJ/mol, o aproximadamente 70 kcal/mol. ^[2]

Los aminoácidos como la lisina , el ácido glutámico , la glutamina , el ácido aspártico y la asparagina pueden formar enlaces isopeptídicos porque todos contienen un grupo amino o carboxilo en su cadena lateral. Por ejemplo, la formación de un enlace isopeptídico entre las cadenas laterales de la lisina y la glutamina es la siguiente:

• Gln−(C=O)NH2 ₊ Lys-NH3 ₊ ^→ Gln−(C=O)NH−Lys+ _NH4 ⁺

El grupo ε-amino de la lisina también puede reaccionar con el grupo α-carboxilo de cualquier otro aminoácido como en la siguiente reacción:

• Ile-(C=O)O- ⁺ Lys-NH3 ₊ ^→ Ile-(C= O )NH-Lys + _H2O

La formación de enlaces isopeptídicos es típicamente catalizada por enzimas . ^[3] La reacción entre lisina y glutamina, como se muestra arriba, es catalizada por una transglutaminasa . Otro ejemplo de formación de enlaces isopeptídicos catalizada por enzimas es la formación de la molécula de glutatión . El glutatión, un tripéptido , contiene un enlace peptídico normal (entre cisteína y glicina ) y un enlace isopeptídico (entre glutamato y cisteína). La formación del enlace isopeptídico entre el grupo γ-carboxilo del glutamato y el grupo α-amino de la cisteína es catalizada por la enzima γ-glutamilcisteína sintetasa . ^[3] El enlace isopeptídico se forma en lugar de un enlace eupéptido porque las peptidasas intracelulares ^[3] no pueden reconocer este enlace y por lo tanto no hidrolizan el enlace. Un enlace isopeptídico puede formarse espontáneamente como se observa en la maduración de la cápside del bacteriófago HK97 . ^[4] En este caso, el grupo ε-amino de la lisina reacciona autocatalíticamente con el grupo carboxamida de la cadena lateral de la asparagina . ^[4] La formación espontánea de enlaces isopeptídicos entre la lisina y la asparagina también ocurre en los pili bacterianos Gram-positivos . ^[5]

Los enlaces isopeptídicos generados por enzimas tienen dos propósitos biológicos principales: señalización y estructura .

La bioseñalización influye en la función de las proteínas, ^[6] la condensación de la cromatina, ^[7] y la vida media de las proteínas. ^[8] Las funciones bioestructurales de los enlaces isopeptídicos incluyen la coagulación sanguínea ^[9] (para la cicatrización de heridas), el mantenimiento de la matriz extracelular , ^[10] la vía de la apoptosis , ^[10] la modificación de los microtúbulos , ^[11] y la formación de pili patógenos ^[12] en las bacterias. Los enlaces isopeptídicos contribuyen a la patogenicidad de Vibrio cholerae porque el dominio de reticulación de actina (ACD) forma un enlace intermolecular entre el grupo γ-carboxilo del glutamato y el grupo ε-amino de la lisina en la actina . ^{[13] Este proceso detiene} la polimerización de la actina en la célula huésped . ^[13]

En la literatura sobre los enlaces isopeptídicos que unen una proteína con otra con el fin de realizar la transducción de señales, predominan los estudios sobre la ubiquitina y otras proteínas similares. La ubiquitina y sus proteínas relacionadas ( SUMO , Atg8 , Atg12 , etc.) tienden a seguir la misma vía de unión de proteínas. ^[6]

El proceso de ligación de proteínas por ubiquitina y proteínas similares a ubiquitina tiene tres pasos principales. ^[6] En el paso inicial, la proteína activadora específica (E1 o proteína similar a E1) activa la ubiquitina adenilándola con ATP . ^[6] Luego, la ubiquitina adenilada se puede transferir a una cisteína conservada usando un enlace tioéster que está entre el grupo carboxilo de la glicina C-terminal de la ubiquitina y el azufre de la cisteína E1. ^{[6] [14] [15]} La enzima activadora E1 luego se une y transfiere la ubiquitina al siguiente nivel, la enzima E2 que acepta la proteína y una vez más forma un tioéster con un enlace conservado. La E2 actúa hasta cierto punto como un intermediario que luego se une a la enzima ligasa E3 para el nivel final, lo que conduce a la transferencia final de la ubiquitina o proteína relacionada con la ubiquitina a un sitio de lisina en la proteína objetivo, o más comúnmente para la ubiquitina, a la ubiquitina misma para formar cadenas de dicha proteína. ^[14]

Sin embargo, en el nivel final, también hay una divergencia, ya que, dependiendo del tipo de ligasa E3, puede que no esté causando realmente la conjugación. Como existen las ligasas E3 que contienen dominios HECT, en las que continúan esta "cadena de transferencia" aceptando una vez más la ubiquitina a través de otra cisteína conservada y luego dirigiéndola y transfiriéndola al objetivo deseado. Sin embargo, en el caso del dominio RING finger que contiene ese uso de enlaces de coordinación con iones de zinc para estabilizar sus estructuras, actúan más para dirigir la reacción. Con esto se quiere decir que una vez que la ligasa E3 RING finger se une con la E2 que contiene la ubiquitina, simplemente actúa como un dispositivo de orientación que dirige a la E2 para que se una directamente a la proteína objetivo en el sitio de la lisina. ^{[14] [16]}

Aunque en este caso la ubiquitina representa bien a otras proteínas relacionadas con ella, cada proteína obviamente tendrá sus propias molestias como SUMO, que tiende a ser ligasas de dominio de dedo RING, donde el E3 simplemente actúa como el dispositivo de orientación para dirigir la ligadura por el E2, y en realidad no realiza la reacción en sí misma como las ligasas Ubiquitin E3-HECT. ^[15] Por lo tanto, si bien los mecanismos internos difieren, como la forma en que las proteínas participan en la cadena de transferencia, los aspectos químicos generales, como el uso de tioésteres y ligasas específicas para la orientación, siguen siendo los mismos.

La química enzimática involucrada en la formación de isopeptidos para propósitos estructurales es diferente del caso de la ubiquitina y las proteínas relacionadas con la ubiquitina, en el sentido de que, en lugar de pasos secuenciales que involucran múltiples enzimas para activar, conjugar y dirigir el sustrato. ^[17] La ​​catálisis es realizada por una enzima y el único paso precursor, si lo hay, es generalmente la escisión para activarlo a partir de un zimógeno. Sin embargo, la uniformidad que existe en el caso de la ubiquitina no es así aquí, ya que hay numerosas enzimas diferentes que realizan la reacción de formación del enlace isopeptido.

El primer caso es el de las sortasas, una familia de enzimas que se encuentra distribuida en numerosas bacterias gram positivas y que ha demostrado ser un importante factor de patogenicidad y virulencia. La reacción general que realizan las sortasas implica el uso de su propia versión de la "tríada catalítica": es decir, el uso de histidina, arginina y cisteína para el mecanismo reactivo. La histidina y la arginina actúan para ayudar a crear el entorno reactivo, y la cis actúa una vez más como centro de reacción mediante el uso de un tioéster que ayuda a mantener un grupo carboxilo hasta que la amina de una lisina puede realizar un ataque nucleofílico para transferir la proteína y formar el enlace isopeptídico. Un ion que a veces puede desempeñar un papel importante, aunque indirecto, en la reacción enzimática es el calcio, al que se une la sortasa. Desempeña un papel importante en el mantenimiento de la estructura de la enzima en la conformación óptima para la catálisis. Sin embargo, hay casos en los que se ha demostrado que el calcio no es esencial para que se produzca la catálisis. ^[18]

Otro aspecto que distingue a las sortasas en general es que tienen una orientación muy específica para su sustrato, ya que las sortasas tienen generalmente dos funciones, la primera es la fusión de proteínas a la pared celular de la bacteria y la segunda es la polimerización de la pilina. Para el proceso de localización de proteínas a la pared celular existe un triple requisito que la proteína contenga un dominio hidrofóbico, una región de cola cargada positivamente y una secuencia final específica utilizada para el reconocimiento. ^[19] La mejor estudiada de estas señales es la LPXTG, que actúa como el punto de escisión, donde la sortasa ataca entre Thr y Gly, conjugando al grupo carboxilo de Thr. ^[18] Luego, el tioéster se resuelve mediante la transferencia del péptido a una amina primaria, y esto generalmente tiene una especificidad muy alta, lo que se ve en el ejemplo de B. cereus, donde la enzima sortasa D ayuda a polimerizar la proteína BcpA a través de dos señales de reconocimiento, LPXTG como punto de escisión y formación de tioéster, y el sitio YPKN que actúa como señal de reconocimiento como el lugar donde se formará el isopéptido. ^[20] Si bien los detalles pueden variar entre bacterias, los fundamentos de la química enzimática de la sortasa siguen siendo los mismos.

El siguiente caso es el de las transglutaminasas (TGasas), que actúan principalmente dentro de los eucariotas para fusionar diferentes proteínas por diversas razones, como la cicatrización de heridas o la unión de proteínas a las membranas lipídicas. ^{[21] [22]} Las propias TGasas también contienen su propia "tríada catalítica" con histidina, aspartato y cisteína. Las funciones de estos residuos son análogas o iguales a las de las sortasas descritas anteriormente, en las que la His y el Asp desempeñan un papel de apoyo en la interacción con el residuo objetivo, mientras que la Cys forma un tioéster con un grupo carboxilo para un posterior ataque nucleofílico por una amina primaria, en este caso debido al interés de la lisina. Aunque las similitudes con la sortasa catalíticamente comienzan a terminar allí, ya que la enzima y la familia dependen del calcio, que desempeña un papel estructural crucial en el mantenimiento de una conformación ajustada de la enzima. Las TGasas también tienen una especificidad de sustrato muy diferente, ya que se dirigen específicamente a la Gln media, en la secuencia 'Gln-Gln-Val'. La especificidad general del sustrato, es decir, la proteína específica, se debe a la estructura general de las diferentes TGasas que las dirigen al sustrato. ^[23]

Se ha observado la especificidad en las TGasas de tal manera que diferentes TGasas reaccionarán con diferentes Gln en la misma proteína, lo que significa que las enzimas tienen un objetivo inicial muy específico. ^[24] También se ha demostrado que tiene cierta especificidad en cuanto a qué lisina objetivo transfiere la proteína, como en el caso del factor XIII, donde el residuo adyacente a la lisina decide si se producirá la reacción. ^[22] Por lo tanto, si bien las TGasas pueden parecer inicialmente una sortasa eucariota, se sostienen por sí mismas como un conjunto separado de enzimas.

Otro caso de una enzima que se une a isopeptídicos con fines estructurales es el dominio de reticulación de actina (ACD) de la proteína toxina MARTX generada por V. cholerae. Si bien se ha demostrado que el ACD, al realizar la catálisis, utiliza magnesio y ATP para la formación de los enlaces cruzados, los detalles del mecanismo son inciertos. Aunque un aspecto interesante del enlace cruzado formado en este caso es que utiliza un Glu no terminal para ligarse a una Lys no terminal, lo que parece ser poco común en el proceso de formación de un enlace isopeptídico. ^[25] Aunque la química del ACD aún está por resolver, muestra que la formación de enlaces isopeptídicos no depende simplemente de Asp/Asn para los enlaces isopeptídicos no terminales entre proteínas.

El último caso que se analizará es el curioso caso de las modificaciones postraduccionales de la microtubilina (MT). La MT contiene una amplia gama de modificaciones postraduccionales; sin embargo, las dos de mayor interés son la poliglutamilación y la poliglicilación. Ambas modificaciones son similares en el sentido de que son tramos repetidos del mismo aminoácido fusionado al grupo carboxilo de la cadena lateral del glutamato en la región c-terminal de la MT. Los mecanismos enzimáticos no están completamente desarrollados ya que no se sabe mucho sobre la enzima poliglicadora. En el caso de la poliglutamilación, el mecanismo exacto también se desconoce, pero parece ser dependiente de ATP. ^[26] Aunque nuevamente hay una falta de claridad con respecto a la química enzimática, todavía hay información valiosa sobre la formación de enlaces isopeptídicos utilizando el carboxilo del grupo R de Glu junto con el amino N-terminal de los péptidos modificadores.

La formación espontánea de enlaces isopeptídicos se ha aprovechado en el desarrollo de una etiqueta peptídica denominada SpyTag . SpyTag puede reaccionar de forma espontánea e irreversible con su pareja de unión (una proteína denominada SpyCatcher) a través de un enlace isopeptídico covalente. ^[27] Esta herramienta molecular puede tener aplicaciones para la orientación de proteínas in vivo , la microscopía fluorescente y la unión irreversible de una micromatriz de proteínas . A continuación, se desarrollaron otros sistemas Tag/Catcher, como SnoopTag/SnoopCatcher ^[28] y SdyTag/SdyCatcher ^[29] que complementan a SpyTag/SpyCatcher.

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