Microhaz

Un microhaz es un haz estrecho de radiación , de dimensiones micrométricas o submicrométricas. Junto con las técnicas de imagen integradas, los microhaces permiten introducir cantidades de daño definidas con precisión en lugares definidos con precisión. Por lo tanto, el microhaz es una herramienta para que los investigadores estudien los mecanismos intra e intercelulares de transducción de señales de daño .

Básicamente, un sistema de imágenes automatizado localiza objetivos especificados por el usuario, y estos objetivos se irradian secuencialmente, uno por uno, con un haz de radiación altamente enfocado. Los objetivos pueden ser células individuales , ubicaciones subcelulares o ubicaciones precisas en tejidos 3D. Las características clave de un microhaz son el rendimiento, la precisión y la exactitud . Al irradiar regiones específicas, el sistema debe garantizar que las ubicaciones adyacentes no reciban deposición de energía.

Las primeras instalaciones de microhaz se desarrollaron a mediados de los años 90. Estas instalaciones fueron una respuesta a los desafíos que presentaba el estudio de los procesos radiobiológicos mediante exposiciones de haz ancho. Los microhaces se diseñaron originalmente para abordar dos cuestiones principales: ^[1]

1. La creencia de que la sensibilidad a la radiación del núcleo no era uniforme, y
2. La necesidad de poder alcanzar una célula individual con un número exacto (particularmente una) de partículas para evaluar el riesgo de dosis bajas.

Además, los microhaces fueron vistos como vehículos ideales para investigar los mecanismos de respuesta a la radiación.

En aquella época se creía que el daño a las células causado por la radiación era en su totalidad resultado del daño al ADN . Los microhaces de partículas cargadas podían investigar la sensibilidad a la radiación del núcleo, que en aquel momento parecía no ser uniformemente sensible. Los experimentos realizados en instalaciones de microhaces han demostrado desde entonces la existencia de un efecto espectador . Un efecto espectador es cualquier respuesta biológica a la radiación en células o tejidos que no experimentaron un paso transversal de la radiación. Estas células "espectadoras" son vecinas de células que sí experimentaron un paso transversal. Se cree que el mecanismo del efecto espectador se debe a la comunicación entre células. La naturaleza exacta de esta comunicación es un área de investigación activa para muchos grupos.

En las dosis bajas de relevancia para la exposición a la radiación ambiental, las células individuales rara vez experimentan atravesamientos por una partícula ionizante y casi nunca experimentan más de un atravesamiento. Por ejemplo, en el caso de la exposición doméstica al radón , la estimación del riesgo de cáncer involucra estudios epidemiológicos de mineros de uranio. Estos mineros inhalan gas radón, que luego sufre desintegración radiactiva , emitiendo una partícula alfa. Esta partícula alfa atraviesa las células del epitelio bronquial, causando potencialmente cáncer. La exposición promedio de por vida al radón de estos mineros es lo suficientemente alta como para que las estimaciones del riesgo de cáncer estén impulsadas por datos sobre individuos cuyas células bronquiales objetivo están sujetas a múltiples atravesamientos de partículas alfa. Por otro lado, para un ocupante promedio de una casa, aproximadamente 1 de cada 2500 células bronquiales objetivo estarán expuestas por año a una sola partícula alfa, pero menos de 1 de cada 10 ⁷ de estas células experimentarán atravesamientos de más de una partícula. Por lo tanto, para extrapolar desde la exposición de los mineros a la exposición ambiental, es necesario poder extrapolar desde los efectos de múltiples travesías a los efectos de travesías individuales de una partícula.

Debido a la distribución aleatoria de las trayectorias de las partículas, los efectos biológicos de un número exacto (en particular, una) de partículas no se pueden simular prácticamente en el laboratorio utilizando exposiciones convencionales de haz ancho. Las técnicas de microhaz pueden superar esta limitación al suministrar un número exacto (una o más) de partículas por núcleo celular. Las irradiaciones reales de una sola partícula deberían permitir la medición de los efectos de exactamente un recorrido de partículas alfa, en relación con múltiples recorridos. La aplicación de tales sistemas a procesos de baja frecuencia, como la transformación oncogénica, depende en gran medida de la tecnología utilizada. Con una tasa de irradiación de al menos 5.000 células por hora, se pueden realizar prácticamente experimentos con rendimientos del orden de 10 ⁻⁴ . Por lo tanto, un alto rendimiento es una cualidad deseada para los sistemas de microhaz.

Las primeras instalaciones de microhaz que suministraban partículas cargadas. Una instalación de microhaz de partículas cargadas debe cumplir los siguientes requisitos básicos: ^[2]

1. El tamaño del punto del haz debe ser del orden de unos pocos micrómetros o más pequeño, correspondiente a las dimensiones celulares o subcelulares.
2. Las irradiaciones de células vivas deben realizarse a presión atmosférica.
3. La corriente del haz debe reducirse a niveles tales que los objetivos puedan irradiarse con un número exacto de partículas con alta reproducibilidad .
4. Se requiere un sistema de imágenes para visualizar y registrar objetivos celulares.
5. El posicionamiento de la célula debe tener una alta resolución espacial y reproducibilidad para que el haz de iones alcance el objetivo con un alto grado de precisión y exactitud .
6. Un detector de partículas con alta eficiencia debe contar la cantidad de partículas por objetivo y apagar el haz después de que se haya entregado la cantidad deseada de partículas.
7. Las condiciones ambientales (humedad, por ejemplo) de las células deben mantenerse de manera que estén sometidas a poco o ningún estrés .

Se pueden obtener puntos de luz con un diámetro de hasta dos micrómetros colimando el haz con aberturas de orificio pequeño o con un capilar estirado. Se han logrado puntos de luz de tamaño submicrométrico enfocando el haz utilizando diversas combinaciones de lentes electrostáticas o magnéticas. Ambos métodos se utilizan actualmente.

Para realizar experimentos con microhaz en células vivas es necesaria una ventana de vacío. Generalmente, esto se logra con el uso de una ventana hermética al vacío de un polímero de unos pocos micrómetros de espesor o de 100 a 500 nm de espesor , como el nitruro de silicio .

Las células deben identificarse y localizarse con un alto grado de precisión. Esto se puede lograr mediante tinción celular y microscopía de fluorescencia o sin tinción mediante el uso de técnicas como la microscopía de fase cuantitativa o la microscopía de contraste de fase. En última instancia, el objetivo es reconocer las células, localizarlas y colocarlas en posición para la irradiación lo más rápido posible. Se han logrado rendimientos de hasta 15.000 células por hora.

Las partículas deben contarse con un alto grado de eficiencia de detección para garantizar que se entregue una cantidad específica de iones a una sola célula. Por lo general, los detectores se pueden colocar antes o después del objetivo que se va a irradiar. Si el detector se coloca después del objetivo, el haz debe tener suficiente energía para atravesar el objetivo y llegar al detector. Si el detector se coloca antes del objetivo, el detector debe tener un efecto mínimo en el haz. Cuando se detecta la cantidad deseada de partículas, el haz se desvía o se apaga.

Las células vivas deben mantenerse en condiciones que no las estresen , lo que provocaría una respuesta biológica no deseada. Normalmente, las células deben estar unidas a un sustrato para que el sistema de imágenes pueda determinar su posición. Los avances recientes en el control de la posición del haz y en la obtención de imágenes a alta velocidad han hecho posible el flujo continuo de los sistemas ( Flow and Shoot ).

Algunas instalaciones han desarrollado o están desarrollando microhaces de rayos X suaves. En estos sistemas, se utilizan placas zonales para enfocar los rayos X característicos generados a partir de un objetivo alcanzado por un haz de partículas cargadas. Cuando se utilizan rayos X de sincrotrón como fuente, se puede obtener un microhaz de rayos X cortando el haz con un sistema de rendijas preciso debido a la alta direccionalidad de la radiación de sincrotrón .

Se han estudiado muchos puntos finales biológicos, incluida la transformación oncogénica , la apoptosis , las mutaciones y las aberraciones cromosómicas .

Se han celebrado nueve talleres internacionales, que se han celebrado aproximadamente cada dos años, sobre sondas de microhaz de respuesta a la radiación celular. Estos talleres sirven como una oportunidad para que el personal especializado en microhaz se reúna e intercambie ideas. Las actas de los talleres sirven como una excelente referencia sobre el estado de la ciencia relacionada con los microhaz.