Gen reportero
Técnica en biología molecular
Un diagrama de cómo se utiliza un gen reportero para estudiar una secuencia reguladora.

En biología molecular , un gen reportero (a menudo simplemente reportero ) es un gen que los investigadores adjuntan a una secuencia reguladora de otro gen de interés en bacterias , cultivos celulares , animales o plantas. Dichos genes se denominan reporteros porque las características que confieren a los organismos que los expresan se identifican y miden fácilmente, o porque son marcadores seleccionables . Los genes reporteros se utilizan a menudo como una indicación de si un determinado gen ha sido captado o expresado en la población de células u organismos.

Genes reporteros comunes

Para introducir un gen reportero en un organismo, los científicos colocan el gen reportero y el gen de interés en la misma construcción de ADN que se insertará en la célula u organismo. En el caso de las bacterias o células procariotas en cultivo, esto suele ser en forma de una molécula de ADN circular llamada plásmido . En el caso de los virus , esto se conoce como vector viral . Es importante utilizar un gen reportero que no se exprese de forma nativa en la célula u organismo en estudio, ya que la expresión del reportero se utiliza como marcador para la captación exitosa del gen de interés. [1]

Los genes reporteros de uso común que inducen características visualmente identificables generalmente involucran proteínas fluorescentes y luminiscentes . Los ejemplos incluyen el gen que codifica la proteína fluorescente verde de medusa (GFP), que hace que las células que la expresan brillen de color verde bajo luz azul o ultravioleta, [2] la enzima luciferasa , que cataliza una reacción con luciferina para producir luz, y la proteína fluorescente roja del gen dsRed  [fr] . [3] [4] [5] [6] [7] El gen GUS se ha utilizado comúnmente en plantas, pero la luciferasa y la GFP se están volviendo más comunes. [8] [9]

Un marcador común en las bacterias es el gen lacZ de E. coli , que codifica la proteína beta-galactosidasa . [10] Esta enzima hace que las bacterias que expresan el gen se vean azules cuando crecen en un medio que contiene el análogo de sustrato X-gal . Un ejemplo de un marcador seleccionable que también es un marcador en las bacterias es el gen de la acetiltransferasa de cloranfenicol (CAT), que confiere resistencia al antibiótico cloranfenicol . [11]

Nombre del genProducto genéticoEnsayoÁrbitro.
lacZβ-galactosidasaEnsayo enzimático, histoquímico[10]
gatoAcetiltransferasa de cloranfenicolAcetilación del cloranfenicol[11]
buena praxisProteína fluorescente verdeFluorescente[3]
solicitud de propuestasProteína fluorescente rojaMicroscópicamente , Espectrofotometría [12]
lucEnzima luciferasaBioluminiscencia[4]

Ensayos de transformación y transfección

Muchos métodos de transfección y transformación –dos formas de expresar un gen extraño o modificado en un organismo– son eficaces sólo en un pequeño porcentaje de una población sometida a las técnicas. [13] [14] Por lo tanto, es necesario un método para identificar esos pocos eventos de captación de genes con éxito. Los genes reporteros utilizados de esta manera normalmente se expresan bajo su propio promotor (regiones de ADN que inician la transcripción génica) independientemente del del gen de interés introducido; el gen reportero puede expresarse de forma constitutiva (es decir, está "siempre activo") o de forma inducible con una intervención externa como la introducción de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) en el sistema de la β-galactosidasa. [10] Como resultado, la expresión del gen reportero es independiente de la expresión del gen de interés, lo que es una ventaja cuando el gen de interés sólo se expresa en determinadas condiciones específicas o en tejidos a los que es difícil acceder. [1]

En el caso de marcadores seleccionables como CAT, la población de bacterias transfectadas se puede cultivar en un sustrato que contenga cloranfenicol . Solo aquellas células que hayan incorporado con éxito el constructo que contiene el gen CAT sobrevivirán y se multiplicarán en estas condiciones. [11]

Ensayos de expresión genética

Los genes reporteros se pueden utilizar para analizar la expresión de un gen de interés que normalmente es difícil de analizar cuantitativamente. [1] Los genes reporteros pueden producir una proteína que tiene poco efecto obvio o inmediato en el cultivo celular o el organismo. Lo ideal es que no estén presentes en el genoma nativo para poder aislar la expresión del gen reportero como resultado de la expresión del gen de interés. [1] [15]

Para activar los genes reporteros, se pueden expresar de forma constitutiva , donde se unen directamente al gen de interés para crear una fusión génica . [16] Este método es un ejemplo de uso de elementos que actúan en cis , donde los dos genes están bajo los mismos elementos promotores y se transcriben en una única molécula de ARN mensajero . Luego, el ARNm se traduce en proteína. Es importante que ambas proteínas puedan plegarse correctamente en sus conformaciones activas e interactuar con sus sustratos a pesar de estar fusionadas. Al construir el constructo de ADN, generalmente se incluye un segmento de ADN que codifica una región de enlace polipeptídica flexible para que el reportero y el producto génico solo interfieran mínimamente entre sí. [17] [18] Los genes reporteros también se pueden expresar por inducción durante el crecimiento. En estos casos, se utilizan elementos que actúan en trans , como factores de transcripción , para expresar el gen reportero. [19] [20]

Los ensayos de genes reporteros se han utilizado cada vez más en el cribado de alto rendimiento (HTS) para identificar inhibidores de moléculas pequeñas y activadores de proteínas y vías para el descubrimiento de fármacos y la biología química . Debido a que las enzimas reporteras en sí mismas (por ejemplo, la luciferasa de luciérnaga ) pueden ser objetivos directos de moléculas pequeñas y confundir la interpretación de los datos de HTS, se han desarrollado nuevos diseños de reporteros de coincidencia que incorporan supresión de artefactos. [21] [22]

Ensayos de promotores

Los genes indicadores pueden utilizarse para analizar la actividad de un promotor particular en una célula u organismo. [23] En este caso, no hay un "gen de interés" independiente; el gen indicador simplemente se coloca bajo el control del promotor objetivo y la actividad del producto del gen indicador se mide cuantitativamente. Los resultados normalmente se informan en relación con la actividad bajo un promotor "de consenso" que se sabe que induce una fuerte expresión génica. [24]

Usos adicionales

Un uso más complejo de los genes reporteros a gran escala es el cribado de dos híbridos , que tiene como objetivo identificar proteínas que interactúan de forma nativa entre sí in vivo . [25]

Véase también

Referencias

  1. ^ abcd Debnath, Mousumi; Prasad, Godavarthi BKS; Bisen, Prakash S. (2010), Debnath, Mousumi; Prasad, Godavarthi BKS; Bisen, Prakash S. (eds.), "Reporter Gene", Diagnóstico molecular: promesas y posibilidades , Springer Países Bajos, págs. 71–84, doi :10.1007/978-90-481-3261-4_5, ISBN 978-90-481-3261-4
  2. ^ van Thor, Jasper J.; Gensch, Thomas; Hellingwerf, Klaas J.; Johnson, Louise N. (enero de 2002). "La fototransformación de la proteína fluorescente verde con luz ultravioleta y visible conduce a la descarboxilación del glutamato 222". Nature Structural Biology . 9 (1): 37–41. doi :10.1038/nsb739. ISSN  1072-8368. PMID  11740505.
  3. ^ ab Soboleski, Mark R.; Oaks, Jason; Halford, William P. (marzo de 2005). "La proteína fluorescente verde es un indicador cuantitativo de la expresión génica en células eucariotas individuales". The FASEB Journal . 19 (3): 440–442. doi : 10.1096/fj.04-3180fje . ISSN  0892-6638. PMC 1242169 . PMID  15640280. 
  4. ^ ab Smale, ST (1 de mayo de 2010). "Ensayo de luciferasa". Protocolos de Cold Spring Harbor . 2010 (5): pdb.prot5421. doi :10.1101/pdb.prot5421. ISSN  1559-6095. PMID  20439408.
  5. ^ Jach, Guido; Binot, Elke; Frings, Sabine; Luxa, Kerstin; Schell, Jeff (2001). "Uso de la proteína fluorescente roja de Discosoma sp. (dsRED) como reportero para la expresión génica en plantas". The Plant Journal . 28 (4): 483–491. doi :10.1046/j.1365-313X.2001.01153.x. ISSN  1365-313X. PMID  11737785.
  6. ^ Zhang, Qixiang; Walawage, Sriema L.; Tricoli, David M.; Dandekar, Abhaya M.; Leslie, Charles A. (mayo de 2015). "Una proteína fluorescente roja (DsRED) de Discosoma sp. como reportero para la expresión génica en embriones somáticos de nogal". Plant Cell Reports . 34 (5): 861–869. doi :10.1007/s00299-015-1749-1. ISSN  1432-203X. PMID  25627255. S2CID  9184712.
  7. ^ Mikkelsen, Lisbeth; Sarrocco, Sabrina; Lübeck, Mette; Jensen, Dan Funck (1 de junio de 2003). "Expresión de la proteína fluorescente roja DsRed-Express en hongos ascomicetos filamentosos". FEMS Microbiology Letters . 223 (1): 135–139. doi : 10.1016/S0378-1097(03)00355-0 . ISSN  0378-1097. PMID  12799012.
  8. ^ Hull, Gillian A.; Devic, Martine (1995), Jones, Heddwyn (ed.), "El sistema del gen reportero de la β-glucuronidasa (Gus): fusiones; detección espectrofotométrica, fluorométrica e histoquímica", Protocolos de transferencia y expresión de genes de plantas , Métodos en biología molecular, vol. 49, Springer Nueva York, págs. 125-141, doi :10.1385/0-89603-321-x:125, ISBN 978-1-59259-536-5, PMID8563799 ​
  9. ^ Koo, J.; Kim, Y.; Kim, J.; Yeom, M.; Lee, IC; Nam, HG (2007). "Un reportero de fusión GUS/luciferasa para el atrapamiento de genes vegetales y para el ensayo de la actividad del promotor con control dependiente de la luciferina de la estabilidad de la proteína reportera". Fisiología vegetal y celular . 48 (8): 1121–1131. doi : 10.1093/pcp/pcm081 . PMID  17597079.
  10. ^ abc Smale, ST (1 de mayo de 2010). "Ensayo de -galactosidasa". Protocolos de Cold Spring Harbor . 2010 (5): pdb.prot5423. doi :10.1101/pdb.prot5423. ISSN  1559-6095. PMID  20439410.
  11. ^ abc Smale, ST (1 de mayo de 2010). "Ensayo de cloranfenicol acetiltransferasa". Protocolos de Cold Spring Harbor . 2010 (5): pdb.prot5422. doi :10.1101/pdb.prot5422. ISSN  1559-6095. PMID  20439409.
  12. ^ Nordgren, IK; Tavassoli, A (2014). "Un sistema fluorescente bidireccional de dos híbridos para monitorear interacciones proteína-proteína". Molecular BioSystems . 10 (3): 485–90. doi : 10.1039/c3mb70438f . PMID  24382456. S2CID  12713372.
  13. ^ Hanahan, Douglas; Jessee, Joel; Bloom, Fredric R. (1 de enero de 1991), "[4] Transformación de plásmidos de Escherichia coli y otras bacterias", Bacterial Genetic Systems , Methods in Enzymology, vol. 204, Academic Press, págs. 63-113, doi :10.1016/0076-6879(91)04006-a, ISBN 9780121821050, PMID1943786 ​
  14. ^ Hanahan, Douglas (5 de junio de 1983). "Estudios sobre la transformación de Escherichia coli con plásmidos". Revista de biología molecular . 166 (4): 557–580. CiteSeerX 10.1.1.460.2021 . doi :10.1016/S0022-2836(83)80284-8. ISSN  0022-2836. PMID  6345791. 
  15. ^ Archivado en Ghostarchive y Wayback Machine: Promega Corporation, Promega Corporation (22 de octubre de 2014). "Introducción a los ensayos de genes reporteros". YouTube . Consultado el 21 de marzo de 2020 .
  16. ^ de Jong, Hidde; Geiselmann, Johannes (2015). "Genes reporteros fluorescentes y el análisis de redes reguladoras bacterianas". En Maler, Oded; Halász, Ádám; Dang, Thao; Piazza, Carla (eds.). Biología de sistemas híbridos . Apuntes de clase en informática. Vol. 7699. Springer International Publishing. págs. 27–50. doi :10.1007/978-3-319-27656-4_2. ISBN . 978-3-319-27656-4.
  17. ^ Spector, David L.; Goldman, Robert D. (1 de diciembre de 2006). "Construcción y expresión de proteínas de fusión GFP". Protocolos de Cold Spring Harbor . 2006 (7): pdb.prot4649. doi :10.1101/pdb.prot4649. PMID  22484672.
  18. ^ Chen, Xiaoying; Zaro, Jennica; Shen, Wei-Chiang (15 de octubre de 2013). "Enlazadores de proteínas de fusión: propiedad, diseño y funcionalidad". Advanced Drug Delivery Reviews . 65 (10): 1357–1369. doi :10.1016/j.addr.2012.09.039. ISSN  0169-409X. PMC 3726540 . PMID  23026637. 
  19. ^ Hanko, Erik KR; Minton, Nigel P.; Malys, Naglis (1 de enero de 2019), "Capítulo nueve: diseño, clonación y caracterización de sistemas de expresión génica inducible basados ​​en factores de transcripción", en Shukla, Arun K. (ed.), Chemical and Synthetic Biology Approaches To Understand Cellular Functions - Part A , Métodos en enzimología, vol. 621, Academic Press, págs. 153–169, doi :10.1016/bs.mie.2019.02.018, ISBN 978-0-12-818117-1, PMID  31128776, S2CID  91744525 , consultado el 16 de diciembre de 2019
  20. ^ Kallunki, Tuula; Barisic, Marín; Jäättelä, Marja; Liu, Bin (30 de julio de 2019). "¿Cómo elegir el sistema de expresión genética inducible adecuado para estudios en mamíferos?". Células . 8 (8): 796. doi : 10.3390/celdas8080796 . ISSN  2073-4409. PMC 6721553 . PMID  31366153. 
  21. ^ Cheng, KC; Inglese, J. (2012). "Un sistema de gen reportero de coincidencia para el cribado de alto rendimiento". Nature Methods . 9 (10): 937. doi :10.1038/nmeth.2170. PMC 4970863 . PMID  23018994. 
  22. ^ Hasson, SA; Fogel, AI; Wang, C.; MacArthur, R.; Guha, R.; Heman-Ackahc, S.; Martin, S.; Youle, RJ; Inglese, J. (2015). "Perfil quimiogenómico de la expresión endógena de PARK2 utilizando un reportero de coincidencia editado en el genoma". ACS Chem. Biol . 10 (5): 1188–1197. doi :10.1021/cb5010417. PMC 9927027. PMID 25689131.  S2CID 20139739  . 
  23. ^ Jugder, Bat-Erdene; Welch, Jeffrey; Braidy, Nady; Marquis, Christopher P. (26 de julio de 2016). "Construcción y uso de una fusión del promotor de la hidrogenasa soluble (PSH) de Cupriavidus necatorH16 con gfp (proteína fluorescente verde)". PeerJ . 4 : e2269. doi : 10.7717/peerj.2269 . ISSN  2167-8359. PMC 4974937 . PMID  27547572. 
  24. ^ Solberg, Nina; Krauss, Stefan (2013). "Ensayo de luciferasa para estudiar la actividad de un fragmento de ADN promotor clonado". Regulación genética . Métodos en biología molecular. Vol. 977. págs. 65–78. doi :10.1007/978-1-62703-284-1_6. ISBN . 978-1-62703-283-4. ISSN  1940-6029. PMID  23436354.
  25. ^ Brückner, Anna; Polge, Cécile; Lentze, Nicolas; Auerbach, Daniel; Schlattner, Uwe (18 de junio de 2009). "Híbrido doble de levadura, una herramienta poderosa para la biología de sistemas". Revista internacional de ciencias moleculares . 10 (6): 2763–2788. doi : 10.3390/ijms10062763 . ISSN  1422-0067. PMC 2705515 . PMID  19582228. 
  • Aspectos destacados de la investigación e información actualizada sobre los genes reporteros.
  • Tinción de embriones de ratón completos para la actividad de la β-galactosidasa (lacZ)
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