Fosfolipasa D específica de N-acilfosfatidiletanolamina

La fosfolipasa D de N-acilfosfatidiletanolamina ( NAPE-PLD ) es una enzima que cataliza la liberación de N-aciletanolamina (NAE) a partir de N-acilfosfatidiletanolamina (NAPE). Esta es una parte importante del proceso que convierte los lípidos ordinarios en señales químicas como la anandamida y la oleoiletanolamina . En los seres humanos, la proteína NAPE-PLD está codificada por el gen NAPEPLD . ^{[1] [2] [3] [4]}

NAPE-PLD es una actividad enzimática , una fosfolipasa , que actúa sobre los fosfolípidos que se encuentran en la membrana celular . No es la homología sino el resultado químico de su actividad lo que la clasifica como fosfolipasa D. La actividad enzimática se descubrió y caracterizó en una serie de experimentos que culminaron en la publicación en 2004 de un esquema de purificación bioquímica a partir del cual se podía lograr la secuenciación de péptidos . ^[2] Los investigadores homogeneizaron (finamente molidos) corazones de 150 ratas y sometieron el lisado crudo resultante a sedimentación de sacarosa a 105.000 xg para separar las membranas celulares del resto de la célula. Luego, las proteínas integrales de membrana se solubilizaron utilizando octilglucósido y se sometieron a cuatro pasos de cromatografía en columna (columna de intercambio catiónico HiTrap SP HP, columna de intercambio aniónico HiTrap Q, columna de afinidad HiTrap Blue, columna de hidroxiapatita Bio-Gel HTP). Cada uno de estos separa los diferentes tipos de proteínas de membrana en diferentes contenedores de muestra cuando las proteínas se eluyen de la columna a lo largo del tiempo, y al medir la actividad de las muestras en cada contenedor fue posible rastrear cuáles recibieron la enzima activa. La medición de la actividad enzimática se realizó mediante cromatografía de capa fina de un sustrato radiactivo sensible a la actividad enzimática NAPE-PLD: la escisión del sustrato afectó el lugar donde apareció en la placa cuando se detectó la radiación en un analizador de bioimágenes.

El resultado de este extenso procedimiento todavía no fue una proteína pura, pero produjo un número limitado de bandas por SDS-PAGE , y se encontró que una banda de 46 kilodaltons se correlacionaba en intensidad con la actividad enzimática. Esta banda se cortó del gel y se digirió con tripsina , y los péptidos de la misma se separaron entre sí mediante cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa . Los fragmentos resultantes se microsecuenciaron luego mediante una degradación automatizada de Edman . ^[5] Tres correspondían a vimentina , una proteína de filamento intermedio de 56 kDa que se cree que es un contaminante, y los otros dos coincidían con el clon de ADNc posteriormente identificado como NAPE-PLD.

Una vez obtenida esta pista, la identificación pudo ser confirmada mediante un procedimiento menos oneroso: la sobreexpresión del supuesto ADNc de NAPE-PLD en células COS-7 produjo una fuerte actividad enzimática de NAPE-PLD, cuyas características demostraron ser similares a las del extracto de corazón original. ^[2]

La secuencia de ADNc de NAPEPLD predice 396 secuencias de aminoácidos tanto en ratones como en ratas, que son 89% y 90% idénticas a las de los humanos. ^[2] Se encontró que NAPE-PLD no tiene homología con los genes conocidos de la fosfolipasa D , pero puede clasificarse por homología para caer en la familia de metalohidrolasa de zinc del pliegue de beta-lactamasa . En particular, se observó el motivo altamente conservado H X( E / H )X D ( C / R / S / H )X _50–70 H X _15–30 ( C / S / D )X _30–70 H , que, en general, está asociado con la unión de zinc y la reacción de hidrólisis en esta clase de proteínas, lo que llevó a los autores a proponer que la actividad debería estar correlacionada con el contenido de zinc.

Cuando se probó NAPE-PLD recombinante en células COS in vitro , tuvo una actividad similar hacia varios sustratos radiomarcados : N-palmitoilfosfatidiletanolamina, N-araquidonoilfosfatidiletanolamina, N-oleoilfosfatidiletanolamina y N-estearoilfosfatidiletanolamina, todos reaccionaron con una K _m entre 2 y 4 micromolar y una V _max entre 73 y 101 nanomol por miligramo por minuto, según lo calculado por el diagrama de Lineweaver-Burk . ^[2] (Estos generan N- palmitoiletanolamina , anandamida , N - oleoiletanolamina y N-estearoiletanolamina, respectivamente). La enzima también hizo reaccionar N-palmitoil-liso-fosfatidiletanolamina y N-araquidonoil-liso-fosfatidiletanolamina con K _m similar pero a un tercio o un cuarto de la V _max . Estas actividades son consistentes con la observación de que muchos tejidos producen una variedad de N -aciletanolaminas .

Sin embargo, la NAPE-PLD no tenía la capacidad de producir ácido fosfatídico detectable a partir de fosfatidilcolina o fosfatidiletanolamina como lo catalizan otras enzimas de la fosfolipasa D. También carece de la actividad de transfosfatidilación de la fosfolipasa D que permite la creación de alcoholes fosfatidílicos en lugar de ácido fosfatídico en presencia de etanol o butanol .

Esta enzima actúa como el segundo paso de una vía bioquímica iniciada por la creación de N-acilfosfatidiletanolamina , mediante la transferencia de un grupo acilo desde la posición sn -1 del glicerofosfolípido al grupo amino de la fosfatidiletanolamina . ^[2] Si bien la NAPE-PLD contribuye a la biosíntesis de varias NAE en el sistema nervioso central de los mamíferos , no está claro si esta enzima no es responsable de la formación del endocannabinoide anandamida , ya que se ha informado que los ratones knock out de NAPE-PLD tienen niveles de tipo salvaje o niveles muy reducidos de anandamida. ^[6]

Las N-aciletanolaminas liberadas por esta enzima se convierten en sustratos potenciales para la amida hidrolasa de ácidos grasos (FAAH), que hidroliza los ácidos grasos libres de la etanolamina . Los defectos en esta enzima pueden provocar que los productos de NAPE-PLD, como la anandamida, se acumulen hasta niveles 15 veces superiores a los observados normalmente. ^[7]

Esta enzima de membrana forma homodímeros , parcialmente separados por un canal interno de ~9 Å de ancho. ^[8] El pliegue proteico de la metalo beta-lactamasa está adaptado para asociarse con fosfolípidos de membrana . Una cavidad hidrofóbica proporciona una vía de entrada para el sustrato NAPE al sitio activo, donde un centro de zinc binuclear cataliza su hidrólisis. Los ácidos biliares se unen con alta afinidad a bolsillos selectivos en esta cavidad, mejorando el ensamblaje de dímeros y permitiendo la catálisis. NAPE-PLD facilita la comunicación cruzada entre las señales de ácidos biliares y las señales de amida lipídica. ^{[8] [9] [10]}