Ensayo de hemaglutinación

El ensayo de hemaglutinación o ensayo de hemaglutinación ( HA ) y el ensayo de inhibición de la hemaglutinación ( HI o HAI ) fueron desarrollados en 1941-42 por el virólogo estadounidense George Hirst como métodos para cuantificar la concentración relativa de virus , bacterias o anticuerpos. ^[1]

La HA y la HAI aplican el proceso de hemaglutinación , en el que los receptores de ácido siálico en la superficie de los glóbulos rojos (RBC) se unen a la glicoproteína hemaglutinina que se encuentra en la superficie del virus de la influenza (y varios otros virus) y crean una red, o estructura reticular, de glóbulos rojos y partículas virales interconectados. ^[2] La red aglutinada mantiene los glóbulos rojos en una distribución suspendida, típicamente vista como una solución rojiza difusa. La formación de la red depende de las concentraciones del virus y los glóbulos rojos, y cuando la concentración relativa del virus es demasiado baja, los glóbulos rojos no están restringidos por la red y se depositan en el fondo del pocillo. La hemaglutinación se observa en presencia de estafilococos, vibrios y otras especies bacterianas, similar al mecanismo que utilizan los virus para causar la aglutinación de los eritrocitos. ^{[3] [4]} Los glóbulos rojos utilizados en los ensayos de HA y HI suelen ser de pollos, pavos, caballos, conejillos de indias o humanos, dependiendo de la selectividad del virus o bacteria de que se trate y de los receptores de superficie asociados en el glóbulos rojos.

Un procedimiento general para HA es el siguiente: se prepara una dilución seriada del virus en las filas de una microplaca de 96 pocillos con forma de U o V. ^[5] La muestra más concentrada en el primer pocillo se diluye a menudo hasta que sea 1/5x del stock, y los pocillos posteriores suelen ser diluciones dobles (1/10, 1/20, 1/40, etc.). El pocillo final sirve como control negativo sin virus. Cada fila de la placa suele tener un virus diferente y el mismo patrón de diluciones. Después de las diluciones seriadas, se añade una concentración estandarizada de glóbulos rojos a cada pocillo y se mezcla suavemente. La placa se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después del período de incubación, el ensayo se puede analizar para distinguir entre pocillos aglutinados y no aglutinados. Las imágenes de una fila generalmente progresarán desde pocillos aglutinados con alta concentración de virus y una apariencia rojiza difusa hasta una serie de pocillos con bajas concentraciones de virus que contienen un gránulo rojo oscuro, o botón, en el centro del pocillo. Los pocillos de baja concentración parecen casi idénticos al pocillo de control negativo sin virus. La apariencia de botón se produce porque los glóbulos rojos no se mantienen en la estructura reticular aglutinada y se depositan en el punto más bajo del pocillo con fondo en U o V. La transición de pocillos aglutinados a no aglutinados ocurre de manera distintiva, en 1 o 2 pocillos.

La concentración relativa, o título, de la muestra de virus se basa en el pocillo con la última apariencia aglutinada, inmediatamente antes de que se observe un sedimento. ^[6] En relación con la concentración inicial de la reserva viral, la concentración de virus en este pocillo será una dilución de la reserva, por ejemplo, 1/40. El valor del título de esa muestra es el inverso de la dilución, es decir, 40. En algunos casos, el virus está inicialmente tan diluido que nunca se observan pocillos aglutinados. En ese caso, el título de estas muestras se asigna comúnmente como 5, lo que indica la concentración más alta posible, pero la precisión de ese valor es claramente baja. Alternativamente, si la concentración relativa del virus es extremadamente alta y los pocillos nunca pasan a una apariencia de botón, el valor del título se asigna comúnmente como la dilución más alta, como 5120.

El HI está estrechamente relacionado con el ensayo HA, pero incluye anticuerpos antivirales como “inhibidores” para interferir con la interacción virus-RBC. El objetivo es caracterizar la concentración de anticuerpos en el antisuero u otras muestras que contienen anticuerpos. ^[7] El ensayo HI generalmente se realiza creando una serie de diluciones de antisuero en las filas de una microplaca de 96 pocillos. Cada fila normalmente sería una muestra diferente. Se agrega una cantidad estandarizada de virus o bacterias a cada pocillo y la mezcla se deja incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. El último pocillo de cada fila sería un control negativo sin virus agregado. Durante la incubación, los anticuerpos se unen a las partículas virales y, si la concentración y la afinidad de unión de los anticuerpos son lo suficientemente altas, las partículas virales se bloquean de manera efectiva para que no provoquen hemaglutinación. ^[8] A continuación, se agrega una cantidad estandarizada de glóbulos rojos a cada pocillo y se deja incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos adicionales. Las imágenes de la placa HI ​​resultantes generalmente progresan desde pocillos no aglutinados, en forma de “botón”, con una alta concentración de anticuerpos, hasta pocillos aglutinados, rojos y difusos, con una baja concentración de anticuerpos. El valor del título de HI es el inverso de la última dilución del suero que inhibió por completo la hemaglutinación. ^[9]

Las descripciones anteriores de los procesos HA e HI son generalizadas, y los detalles específicos pueden variar según el operador y el laboratorio. Por ejemplo, se describen diluciones seriadas a lo largo de las filas, pero algunos laboratorios utilizan una orientación alternativa y realizan diluciones a lo largo de las columnas. De manera similar, la dilución inicial, el factor de dilución seriada, los tiempos de incubación y la elección de la placa con fondo en U o en V pueden depender del laboratorio específico.

Las ventajas de los análisis HA y HI son que son sencillos, utilizan instrumentos y suministros relativamente económicos y disponibles y brindan resultados en pocas horas. Además, estos análisis están bien establecidos en muchos laboratorios de todo el mundo, lo que permite cierto grado de credibilidad, comparación y estandarización. ^{[10] [11]}

Para obtener resultados óptimos y fiables es necesario controlar varias variables, como los tiempos de incubación, la concentración de glóbulos rojos y el tipo de glóbulo rojo. ^[12] Los factores no específicos de la muestra pueden provocar interferencias y valores de titulación incorrectos. Por ejemplo, las moléculas de la muestra que no sean anticuerpos específicos del virus pueden inhibir la aglutinación entre el virus y los glóbulos rojos, así como bloquear potencialmente la unión del anticuerpo al virus. Las enzimas destructoras de receptores (RDE) se utilizan habitualmente para tratar las muestras antes del análisis con el fin de evitar la inhibición no específica. ^[13] El análisis de los resultados de HA o HI depende de que una persona cualificada lea la placa y determine los valores de titulación. El método de interpretación manual introduce más oportunidades de discrepancias en el ensayo porque los resultados pueden ser subjetivos y el acuerdo entre los lectores humanos es inconsistente. ^[14] Además, no hay un registro digital de las determinaciones de la placa o de la titulación, por lo que la interpretación inicial es tediosa y normalmente se realiza por réplicas. La variedad de posibles variables y diferencias entre lectores expertos puede dificultar la comparación de los resultados entre laboratorios. ^[15]

• Hemaglutinación
• Cuantificación del virus