Ensayo de cambio de movilidad electroforética
Técnica utilizada para estudiar el ADN y el ARN
El carril 1 es un control negativo y contiene únicamente material genético. El carril 2 contiene proteína y un fragmento de ADN que, según su secuencia, no interactúa. El carril 3 contiene proteína y un fragmento de ADN que sí reacciona; el complejo resultante es más grande, más pesado y de movimiento más lento. El patrón que se muestra en el carril 3 es el que resultaría si todo el ADN estuviera unido y no se produjera ninguna disociación del complejo durante la electroforesis. Cuando no se cumplen estas condiciones, puede verse una segunda banda en el carril 3 que refleja la presencia de ADN libre o la disociación del complejo ADN-proteína.
Esquema de un EMSA que muestra un cambio de gel en respuesta a una mayor cantidad de proteína
Esquema de un EMSA que muestra cómo el ADN marcado (banda oscura) se mueve hacia arriba en el gel a medida que se agrega más proteína, como lo indica el triángulo a continuación.

Un ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética (EMSA) o electroforesis de desplazamiento de movilidad , también conocido como ensayo de desplazamiento de gel , ensayo de desplazamiento de movilidad de gel , ensayo de desplazamiento de banda o ensayo de retardo de gel , es una técnica de electroforesis de afinidad común utilizada para estudiar las interacciones proteína-ADN o proteína - ARN . Este procedimiento puede determinar si una proteína o mezcla de proteínas es capaz de unirse a una secuencia de ADN o ARN dada, y a veces puede indicar si más de una molécula de proteína está involucrada en el complejo de unión. Los ensayos de desplazamiento de gel a menudo se realizan in vitro simultáneamente con la huella de DNasa , la extensión de cebadores y los experimentos de promotor-sonda cuando se estudia la iniciación de la transcripción , la replicación de grupos de ADN, la reparación del ADN o el procesamiento y maduración del ARN, así como el empalme del pre-ARNm. [1] Aunque se pueden encontrar precursores en la literatura anterior, la mayoría de los ensayos actuales se basan en métodos descritos por Garner y Revzin [2] y Fried y Crothers . [3]

Principio

Un ensayo de cambio de movilidad es la separación electroforética de una mezcla de proteína-ADN o proteína-ARN en un gel de poliacrilamida o agarosa durante un período corto (alrededor de 1,5 a 2 horas para un gel de 15 a 20 cm). [4] La velocidad a la que diferentes moléculas (y combinaciones de las mismas) se mueven a través del gel está determinada por su tamaño y carga, y en menor medida, su forma (ver electroforesis en gel ). El carril de control (sonda de ADN sin proteína presente) contendrá una sola banda correspondiente al fragmento de ADN o ARN no unido. Sin embargo, suponiendo que la proteína es capaz de unirse al fragmento, el carril con una proteína que se une presente contendrá otra banda que representa el complejo más grande y menos móvil de sonda de ácido nucleico unida a proteína que se "desplaza" hacia arriba en el gel (ya que se ha movido más lentamente).

En las condiciones experimentales correctas, la interacción entre el ADN (o ARN) y la proteína se estabiliza y la proporción de ácido nucleico unido a no unido en el gel refleja la fracción de moléculas de sonda libres y unidas a medida que la reacción de unión entra en el gel. Esta estabilidad se debe en parte a un "efecto de jaula", en el que la proteína, rodeada por la matriz del gel, no puede difundirse lejos de la sonda antes de que se recombinen. [5] Si se conocen las concentraciones iniciales de proteína y sonda, y si se conoce la estequiometría del complejo, se puede determinar la afinidad aparente de la proteína por la secuencia de ácido nucleico. [6] A menos que el complejo tenga una vida muy larga en condiciones de gel, o se tenga en cuenta la disociación durante la electroforesis, el número derivado es una Kd aparente. Si no se conoce la concentración de proteína pero sí la estequiometría del complejo, la concentración de proteína se puede determinar aumentando la concentración de sonda de ADN hasta que los incrementos adicionales no aumenten la fracción de proteína unida. En comparación con un conjunto de diluciones estándar de sonda libre aplicadas en el mismo gel, se puede calcular el número de moles de proteína. [4]

Variantes y añadidos

Se puede añadir a esta mezcla un anticuerpo que reconoce la proteína para crear un complejo aún más grande con un desplazamiento mayor. Este método se denomina ensayo de superdesplazamiento y se utiliza para identificar de forma inequívoca una proteína presente en el complejo proteína-ácido nucleico.

A menudo, se utiliza un carril adicional con un oligonucleótido competidor para determinar la secuencia de unión más favorable para la proteína de unión. El uso de diferentes oligonucleótidos de secuencia definida permite la identificación del sitio de unión preciso por competencia (no se muestra en el diagrama). Las variantes del ensayo de competencia son útiles para medir la especificidad de la unión y para medir la cinética de asociación y disociación. Por lo tanto, EMSA también se puede utilizar como parte de un experimento SELEX para seleccionar oligonucleótidos que realmente se unan a una proteína determinada. [ cita requerida ]

Una vez que se determina la unión de ADN-proteína in vitro , una serie de algoritmos pueden limitar la búsqueda para la identificación del factor de transcripción. Los oligonucleótidos de secuencia de consenso para el factor de transcripción de interés podrán competir por la unión, eliminando la banda desplazada, y deben confirmarse mediante supershift. Si la secuencia de consenso prevista no puede competir por la unión, la identificación del factor de transcripción puede verse facilitada por EMSA competidor multiplexado (MC-EMSA), mediante el cual se multiplexan grandes conjuntos de secuencias de consenso en cada reacción y, cuando un conjunto compite por la unión, las secuencias de consenso individuales de este conjunto se ejecutan en una reacción posterior. [7]

Para fines de visualización, el fragmento de ácido nucleico generalmente se marca con un marcador radioactivo , fluorescente o de biotina . La tinción estándar con bromuro de etidio es menos sensible que estos métodos y puede carecer de la sensibilidad para detectar el ácido nucleico si se utilizan pequeñas cantidades de ácido nucleico o ácidos nucleicos monocatenarios en estos experimentos. Cuando se utiliza un marcador de biotina, se utiliza estreptavidina conjugada con una enzima como la peroxidasa de rábano picante para detectar el fragmento de ADN. [8] [9] Si bien el marcado de ADN isotópico tiene poco o ningún efecto sobre la afinidad de unión de proteínas, el uso de marcadores no isotópicos, incluidos fluoróforos o biotina, puede alterar la afinidad y/o la estequiometría de la interacción proteica de interés. La competencia entre la sonda marcada con fluoróforo o biotina y el ADN no marcado de la misma secuencia se puede utilizar para determinar si el marcador altera la afinidad de unión o la estequiometría.

Referencias

  1. ^ Granadino B, Penalva LO, Green MR, Valcarcel J, Sanchez L. 1997. Proc Natl Acad Sci USA 94: 7343-8.
  2. ^ Garner MM, Revzin A (julio de 1981). "Un método de electroforesis en gel para cuantificar la unión de proteínas a regiones específicas de ADN: aplicación a componentes del sistema regulador del operón de lactosa de Escherichia coli". Nucleic Acids Res . 9 (13): 3047–60. doi :10.1093/nar/9.13.3047. PMC  327330 . PMID  6269071.
  3. ^ Fried M, Crothers DM (diciembre de 1981). "Equilibrios y cinética de las interacciones entre el represor y el operador lac mediante electroforesis en gel de poliacrilamida". Nucleic Acids Res . 9 (23): 6505–25. doi :10.1093/nar/9.23.6505. PMC 327619 . PMID  6275366. 
  4. ^ ab Ausubel, Frederick M. (1994). Protocolos actuales en biología molecular . Chichester: John Wiley & Sons. págs. 12.2.1–11. ISBN 0-471-50337-1.
  5. ^ Fried MG, Liu G (1994). "El secuestro molecular estabiliza los complejos CAP-ADN durante la electroforesis en gel de poliacrilamida". Nucleic Acids Research . 22 (23): 5054–5059. doi :10.1093/nar/22.23.5054. PMC 523777 . PMID  7800499. 
  6. ^ Fried MG (1989). "Medición de parámetros de interacción proteína-ADN mediante ensayo de desplazamiento de movilidad por electroforesis". Electroforesis . 10 (5–6): 366–376. doi :10.1002/elps.1150100515. PMID  2670548. S2CID  19372331.
  7. ^ Smith AJ, Humphries SE (enero de 2009). "Caracterización de proteínas de unión al ADN utilizando EMSA competidor multiplexado". J. Mol. Biol . 385 (3): 714–7. doi :10.1016/j.jmb.2008.11.035. PMID  19059416.
  8. ^ Hellman, Lance M; Fried, Michael G (2007). "Ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética (EMSA) para detectar interacciones proteína-ácido nucleico". Nature Protocols . 2 (8): 1849–1861. doi :10.1038/nprot.2007.249. ISSN  1754-2189. PMC 2757439 . PMID  17703195. 
  9. ^ Osmosensing y Osmosignaling. Academic Press. 1 de octubre de 2007. pp. 288–. ISBN 978-0-08-055211-8.
  • Protocolo de desplazamiento de gel quimioluminiscente
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