Elemento P

Los elementos P son elementos transponibles que se descubrieron en Drosophila como agentes causantes de rasgos genéticos llamados disgenesia híbrida. El transposón es responsable del rasgo P del elemento P y se encuentra únicamente en moscas silvestres. También se encuentran en muchos otros eucariotas. ^[1]

El nombre fue sugerido por primera vez por la bióloga evolutiva Margaret Kidwell , quien, junto con James Kidwell y John Sved, investigó la disgenesia híbrida en Drosophila . Se referían a las cepas como P de paterna y M de materna si contribuían a la disgenesia híbrida en esta función reproductiva. ^[2]

El elemento P codifica una enzima conocida como transposasa P. A diferencia de las hembras criadas en laboratorio, se cree que las hembras de tipo salvaje también expresan un inhibidor de la función de la transposasa P , producido por el mismo elemento. Este inhibidor reduce la alteración del genoma causada por el movimiento de los elementos P , lo que permite una progenie fértil. La evidencia de esto proviene de cruces de hembras de laboratorio (que carecen del inhibidor de la transposasa P ) con machos de tipo salvaje (que tienen elementos P ). En ausencia del inhibidor, los elementos P pueden proliferar en todo el genoma, alterando muchos genes y a menudo resultando letales para la progenie o volviéndola estéril.

Los elementos P se utilizan comúnmente como agentes mutagénicos en experimentos genéticos con Drosophila . Una ventaja de este enfoque es que las mutaciones son fáciles de localizar. En la disgenesia híbrida, una cepa de Drosophila se aparea con otra cepa de Drosophila , produciendo descendencia híbrida y causando daño cromosómico conocido por ser disgénico. La disgenesia híbrida requiere una contribución de ambos progenitores. Por ejemplo, en el sistema PM , donde la cepa P contribuye paternalmente y la cepa M contribuye maternalmente, puede ocurrir disgenesia. El cruce inverso, con un padre de citotipo M y una madre P , produce descendencia normal, ya que se cruza de manera P x P o M x M. Los cromosomas masculinos P pueden causar disgenesia cuando se cruzan con una hembra M.

El elemento P es un transposón de clase II y se mueve mediante un mecanismo de "cortar y pegar" basado en ADN. La secuencia de reconocimiento comprende cuatro exones separados por tres intrones . ^[3] El empalme completo de los intrones produce la enzima transposasa, mientras que el empalme parcial alternativo de los intrones 1 y 2, dejando solo el intrón 3 en la transcripción del ARNm, codifica el represor del elemento P. El elemento P completo y autónomo codifica una enzima transposasa, que reconoce las repeticiones invertidas terminales de 31 pb en cada extremo del elemento P y cataliza la escisión y reinserción del elemento P. El elemento completo tiene una longitud de 2.907 pb; los elementos P no autónomos contienen una deleción interna de longitud variable que elimina la producción de transposasa, pero dichos elementos aún pueden movilizarse si se codifica una transposasa funcional en otra parte del genoma. La inserción del elemento P y la posterior escisión necesariamente dejan repeticiones directas de 8 pb en el sitio de escisión; por lo tanto, la presencia de dichas repeticiones es indicativa de actividad previa del elemento P.

Todos los elementos P tienen una estructura canónica que contiene repeticiones invertidas terminales de 31 pb y repeticiones invertidas internas de 11 pb ubicadas en el dominio THAP de la transposasa. Los elementos P más cortos y más largos son elementos no autónomos. Los elementos P más largos codifican la transposasa necesaria para la transposición. La misma secuencia que codifica la transposasa también codifica un supresor de la transposición, que se acumula en el citoplasma durante el desarrollo de las células. Por lo tanto, en un cruce de un macho P o M con una hembra P , el citoplasma femenino contiene el supresor, que se une a cualquier elemento P y evita su transposición.

La disgenesia híbrida se refiere a la alta tasa de mutación en las células de la línea germinal de las cepas de Drosophila resultante de un cruce de machos con elementos P autónomos ( cepa P /citotipo P ) y hembras que carecen de elementos P ( cepa M / citotipo M ). El síndrome de disgenesia híbrida se caracteriza por esterilidad dependiente de la temperatura, tasas elevadas de mutación y aumento de la recombinación y reordenamiento cromosómico.

El fenotipo de disgenesia híbrida se ve afectado por la transposición de elementos P dentro de las células de la línea germinal de los descendientes de machos de la cepa P con hembras de la cepa M. La transposición solo ocurre en las células de la línea germinal, porque el evento de empalme necesario para producir el ARNm de la transposasa no ocurre en las células somáticas.

La disgenesia híbrida se manifiesta cuando se cruzan machos de la cepa P con hembras de la cepa M y no cuando se cruzan hembras de la cepa P (hembras con elementos P autónomos ) con machos de la cepa M. Los óvulos de las hembras de la cepa P contienen altas cantidades de una proteína represora que impide la transcripción del gen de la transposasa. Los óvulos de las madres de la cepa M , que no contienen la proteína represora, permiten la transposición de elementos P del esperma de los padres. En las hembras de la cepa P , los represores se encuentran en el citoplasma. Por lo tanto, cuando los machos de la cepa P fecundan a las hembras de la cepa M (cuyo citoplasma no contiene represor), el macho aporta su genoma con el elemento P pero no el citoplasma masculino dando lugar a la progenie de la cepa P. ^[3]

Este efecto contribuye a que los piRNA se hereden solo en la línea materna, lo que proporciona un mecanismo de defensa contra los elementos P. ^[4]

El elemento P ha encontrado un amplio uso en la investigación de Drosophila como mutágeno. El sistema de mutagénesis generalmente utiliza un elemento autónomo pero inmóvil y un elemento móvil no autónomo. Las moscas de generaciones posteriores pueden entonces ser examinadas por fenotipo o PCR . Los elementos P que ocurren naturalmente contienen secuencias codificantes para la enzima transposasa y secuencias de reconocimiento para la acción de la transposasa. La transposasa regula y cataliza la escisión de un elemento P del ADN del huésped, cortando en los dos sitios de reconocimiento y luego reinsertando aleatoriamente. Es la inserción aleatoria la que puede interferir con genes existentes, o llevar un gen adicional, que puede usarse para la investigación genética.

Para utilizar esto como una herramienta genética útil y controlable, las dos partes del elemento P deben estar separadas para evitar una transposición incontrolada. Las herramientas genéticas normales son el ADN que codifica la transposasa sin secuencias de reconocimiento de la transposasa, por lo que no puede insertarse, y un " plásmido P ". Los plásmidos P siempre contienen un gen reportero de Drosophila , a menudo un marcador de ojos rojos (el producto del gen blanco ) y secuencias de reconocimiento de transposasa. Pueden contener un gen de interés, un gen marcador seleccionable de E. coli , a menudo algún tipo de resistencia a los antibióticos , un origen de replicación u otras secuencias de "mantenimiento" del plásmido asociadas .

Hay dos formas principales de utilizar estas herramientas:

1. Clonar el elemento P en un plásmido y transformarlo y cultivarlo en bacterias.
2. Elimina la transposasa P y reemplázala con el gen de tu interés.
3. Microinyectar el extremo posterior de un embrión en etapa temprana (precelularización) con ADN que codifica para la transposasa y un plásmido con el gen reportero, el gen de interés y las secuencias de reconocimiento de la transposasa.
4. Se produce una transposición aleatoria, insertando el gen de interés y el gen reportero.
5. Una vez insertado el gen de interés ya no es móvil porque no puede producir su propia transposasa P.
6. Cultivar moscas y cruzarlas para eliminar la variación genética entre las células del organismo. (Solo algunas de las células del organismo se habrán transformado. Con suerte, algunas de estas células transformadas terminarán en la línea germinal. Un gameto transformado dará lugar a un organismo sin variación entre sus células).
7. Busque moscas que expresen el gen reportero. Estas tienen el gen insertado de interés, por lo que se pueden investigar para determinar el fenotipo debido al gen de interés.

El gen insertado puede haber dañado la función de uno de los genes del huésped. Se requieren varias líneas de moscas para poder realizar la comparación y garantizar que no se hayan eliminado genes adicionales.

1. Microinyectar el embrión con ADN que codifica la transposasa y un plásmido con el gen reportero y las secuencias de reconocimiento de la transposasa (y a menudo el gen reportero de E. coli y el origen de replicación, etc.).
2. Se produce una transposición aleatoria, en la que el gen reportero se inserta de forma aleatoria. La inserción suele producirse cerca de genes que se transcriben activamente, ya que es allí donde la estructura de la cromatina es más laxa, por lo que el ADN es más accesible.
3. Cultivar moscas y cruzarlas para eliminar la variación genética entre las células del organismo (ver arriba).
4. Busque moscas que expresen el gen reportero. Estas han experimentado una transposición exitosa, por lo que se pueden investigar para determinar el fenotipo debido a la mutación de genes existentes.

Posibles mutaciones:

1. Inserción en una región traducida => proteína híbrida/proteína truncada. Generalmente causa pérdida de la función de la proteína, aunque se observan efectos más complejos.
2. Inserción en un intrón => patrón de empalme alterado /fallo de empalme. Generalmente da como resultado el truncamiento de la proteína o la producción de productos empalmados incorrectamente inactivos, aunque son comunes los efectos más complejos.
3. Inserción en la región no traducida 5' (la secuencia que se convertirá en el UTR 5' del ARNm) => truncamiento de la transcripción. Generalmente, el ARNm no contiene una tapa 5' , lo que lleva a una traducción menos eficiente.
4. Inserción en el promotor => reducción/pérdida completa de la expresión. Siempre da como resultado niveles de producción de proteína muy reducidos. Es el tipo de inserción más útil para el análisis debido a la simplicidad de la situación.
5. Inserción entre el promotor y los potenciadores ascendentes => pérdida de la función potenciadora/secuestro de la función potenciadora para el gen reportero.† Generalmente reduce el nivel de especificidad de la proteína para el tipo de célula, aunque a menudo se observan efectos complejos.

El secuestro de un potenciador de otro gen permite el análisis de la función de ese potenciador. Esto, especialmente si el gen reportero es para una proteína fluorescente, se puede utilizar para ayudar a mapear la expresión del gen mutado a través del organismo y es una herramienta muy poderosa. Es una herramienta útil para observar patrones de expresión genética (temporal y espacialmente).

Estos métodos se denominan genética inversa. La genética inversa es un enfoque para descubrir la función de un gen mediante el análisis de los efectos fenotípicos de secuencias genéticas específicas obtenidas mediante secuenciación de ADN.

Una vez determinada la función de la proteína mutada es posible secuenciar/purificar/clonar las regiones que flanquean la inserción mediante los siguientes métodos:

1. Aislar el genoma de la mosca.
2. Someterse a una digestión ligera (utilizando una enzima [enzima 1] que se sabe que NO corta el gen reportero), dando lugar a fragmentos de unas pocas kilobases, algunas con la inserción y su ADN flanqueante.
3. Autoligar el digesto (baja concentración de ADN para asegurar la autoligación) dando una selección de fragmentos de ADN circulares, algunos con la inserción y su ADN flanqueante.
4. Cortar los plásmidos en algún punto del gen reportero (con una enzima [enzima 2] que se sabe que corta muy raramente en el ADN genómico, pero que sí lo hace en el gen reportero).
5. Utilizando cebadores para las secciones del gen reportero, se puede amplificar el ADN para secuenciarlo .

El proceso de corte, autoligación y re-corte permite la amplificación de las regiones flanqueantes del ADN sin conocer la secuencia. El punto en el que se produjo la ligación se puede ver identificando el sitio de corte de [enzima 1].

1. Aislar el genoma de la mosca.
2. Someterse a una digestión ligera (utilizando una enzima [enzima 1] conocida por cortar el límite entre el gen reportero y el gen reportero de E. coli y las secuencias del plásmido), dando lugar a fragmentos de unas pocas kilobases, algunas con el reportero de E. coli , las secuencias del plásmido y su ADN flanqueante.
3. Autoligar el digesto (baja concentración de ADN para asegurar la autoligación) dando una selección de fragmentos de ADN circulares, algunos con el reportero de E. coli , las secuencias del plásmido y su ADN flanqueante.
4. Insertar los plásmidos en células de E. coli (por ejemplo, mediante electroporación).
5. Seleccionar plásmidos para el gen marcador seleccionable de E. coli . Solo las inserciones exitosas de plásmidos con las secuencias de "mantenimiento" del plásmido expresarán este gen.
6. El gen se puede clonar para su posterior análisis.

• Leland Hartwell et al. 2004. Genética: de los genes a los genomas 2.ª edición. McGraw-Hill
• Engels, WR P Elementos en Drosophila

• Base de vuelo