Electroforesis en gel
Método de separación y análisis de biomoléculas.

Electroforesis en gel
Aparato de electroforesis en gel: se coloca un gel de agarosa en esta caja llena de tampón y se aplica una corriente eléctrica a través de la fuente de alimentación en la parte posterior. El terminal negativo está en el extremo más alejado (cable negro), por lo que el ADN migra hacia el ánodo con carga positiva (cable rojo). Esto ocurre porque los grupos de fosfato que se encuentran en los fragmentos de ADN poseen una carga negativa que es repelida por el cátodo con carga negativa y son atraídos por el ánodo con carga positiva.
ClasificaciónElectroforesis
Otras técnicas
RelacionadoElectroforesis capilar
SDS-PAGE
Electroforesis en gel bidimensional Electroforesis
en gel con gradiente de temperatura
La imagen de arriba muestra cómo los fragmentos de ADN pequeños migran a través de la agarosa rápidamente, pero los fragmentos de ADN de gran tamaño se mueven más lentamente durante la electroforesis. El gráfico de la derecha muestra la relación no lineal entre el tamaño del fragmento de ADN y la distancia migrada.
La electroforesis en gel es un proceso en el que se aplica una corriente eléctrica a muestras de ADN creando fragmentos que pueden usarse para comparar entre muestras de ADN.
  1. Se extrae el ADN.
  2. Aislamiento y amplificación de ADN.
  3. ADN añadido a los pocillos de gel.
  4. Corriente eléctrica aplicada al gel.
  5. Las bandas de ADN están separadas por tamaño.
  6. Las bandas de ADN están teñidas.

La electroforesis en gel es un método de separación y análisis de biomacromoléculas ( ADN , ARN , proteínas , etc.) y sus fragmentos, en función de su tamaño y carga. Se utiliza en química clínica para separar proteínas por carga o tamaño (IEF agarosa, esencialmente independiente del tamaño) y en bioquímica y biología molecular para separar una población mixta de fragmentos de ADN y ARN por longitud, para estimar el tamaño de los fragmentos de ADN y ARN o para separar proteínas por carga. [1]

Las moléculas de ácido nucleico se separan aplicando un campo eléctrico para mover las moléculas con carga negativa a través de una matriz de agarosa u otras sustancias. Las moléculas más cortas se mueven más rápido y migran más lejos que las más largas porque las moléculas más cortas migran más fácilmente a través de los poros del gel. Este fenómeno se llama tamizado. [2] Las proteínas se separan por la carga en la agarosa porque los poros del gel son demasiado grandes para tamizar las proteínas. La electroforesis en gel también se puede utilizar para la separación de nanopartículas .

La electroforesis en gel utiliza un gel como medio anticonvectivo o medio de tamizado durante la electroforesis, el movimiento de una partícula cargada en una corriente eléctrica. Los geles suprimen la convección térmica causada por la aplicación del campo eléctrico y también pueden actuar como medio de tamizado, ralentizando el paso de las moléculas; los geles también pueden servir simplemente para mantener la separación finalizada de modo que se pueda aplicar una tinción posterior a la electroforesis. [3] La electroforesis en gel de ADN se realiza generalmente con fines analíticos, a menudo después de la amplificación del ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), pero puede usarse como una técnica preparativa antes del uso de otros métodos como la espectrometría de masas , RFLP , PCR, clonación , secuenciación de ADN o transferencia Southern para una caracterización adicional.

Base física

Descripción general de la electroforesis en gel.

La electroforesis es un proceso que permite clasificar las moléculas en función de su carga, tamaño o forma. Mediante un campo eléctrico, se puede hacer que las moléculas (como el ADN) se desplacen a través de un gel hecho de agarosa o poliacrilamida . El campo eléctrico consta de una carga negativa en un extremo que empuja las moléculas a través del gel y una carga positiva en el otro extremo que tira de las moléculas a través del gel. Las moléculas que se clasifican se dispensan en un pocillo en el material del gel. El gel se coloca en una cámara de electroforesis, que luego se conecta a una fuente de energía. Cuando se aplica el campo eléctrico, las moléculas más grandes se mueven más lentamente a través del gel, mientras que las moléculas más pequeñas se mueven más rápido. Las moléculas de diferentes tamaños forman bandas distintas en el gel. [4]

El término " gel " en este caso se refiere a la matriz utilizada para contener y luego separar las moléculas objetivo. En la mayoría de los casos, el gel es un polímero reticulado cuya composición y porosidad se eligen en función del peso específico y la composición del objetivo a analizar. Al separar proteínas o ácidos nucleicos pequeños ( ADN , ARN u oligonucleótidos ), el gel suele estar compuesto de diferentes concentraciones de acrilamida y un reticulante , lo que produce redes de malla de poliacrilamida de diferentes tamaños. Al separar ácidos nucleicos más grandes (más de unos pocos cientos de bases ), la matriz preferida es agarosa purificada. En ambos casos, el gel forma una matriz sólida, pero porosa. La acrilamida, a diferencia de la poliacrilamida, es una neurotoxina y debe manipularse utilizando las precauciones de seguridad adecuadas para evitar el envenenamiento. La agarosa está compuesta de largas cadenas no ramificadas de carbohidratos sin carga y sin enlaces cruzados, lo que da como resultado un gel con poros grandes que permiten la separación de macromoléculas y complejos macromoleculares . [5]

La electroforesis se refiere a la fuerza electromotriz (FEM) que se utiliza para mover las moléculas a través de la matriz de gel. Al colocar las moléculas en pocillos en el gel y aplicar un campo eléctrico, las moléculas se moverán a través de la matriz a diferentes velocidades, determinadas en gran medida por su masa cuando la relación carga-masa (Z) de todas las especies es uniforme. Sin embargo, cuando las cargas no son todas uniformes, el campo eléctrico generado por el procedimiento de electroforesis hará que las moléculas migren de manera diferencial según la carga. Las especies que tienen carga neta positiva migrarán hacia el cátodo , que tiene carga negativa (porque se trata de una celda electrolítica en lugar de galvánica ), mientras que las especies que tienen carga neta negativa migrarán hacia el ánodo, que tiene carga positiva. La masa sigue siendo un factor en la velocidad con la que estas moléculas con carga no uniforme migran a través de la matriz hacia sus respectivos electrodos. [6]

Si se han cargado varias muestras en pocillos adyacentes en el gel, se desplazarán en paralelo en carriles individuales. Dependiendo del número de moléculas diferentes, cada carril muestra la separación de los componentes de la mezcla original como una o más bandas distintas, una banda por componente. La separación incompleta de los componentes puede dar lugar a bandas superpuestas o manchas indistinguibles que representan múltiples componentes sin resolver. [ cita requerida ] Las bandas en diferentes carriles que terminan a la misma distancia de la parte superior contienen moléculas que pasaron a través del gel a la misma velocidad, lo que generalmente significa que tienen aproximadamente el mismo tamaño. Hay marcadores de tamaño de peso molecular disponibles que contienen una mezcla de moléculas de tamaños conocidos. Si dicho marcador se ejecutara en un carril en el gel paralelo a las muestras desconocidas, las bandas observadas se pueden comparar con las de las desconocidas para determinar su tamaño. La distancia que recorre una banda es aproximadamente inversamente proporcional al logaritmo del tamaño de la molécula (alternativamente, esto se puede expresar como la distancia recorrida es inversamente proporcional al logaritmo del peso molecular de las muestras). [7]

Las técnicas electroforéticas tienen sus límites. Dado que el paso de una corriente a través de un gel provoca un calentamiento, los geles pueden fundirse durante la electroforesis. La electroforesis se realiza en soluciones tampón para reducir los cambios de pH debidos al campo eléctrico, lo cual es importante porque la carga del ADN y el ARN depende del pH, pero si se realiza durante demasiado tiempo se puede agotar la capacidad tampón de la solución. También existen limitaciones para determinar el peso molecular mediante SDS-PAGE, especialmente cuando se intenta encontrar el peso molecular de una proteína desconocida. Ciertas variables biológicas son difíciles o imposibles de minimizar y pueden afectar la migración electroforética. Dichos factores incluyen la estructura de la proteína, las modificaciones postraduccionales y la composición de aminoácidos. Por ejemplo, la tropomiosina es una proteína ácida que migra de forma anormal en geles SDS-PAGE. Esto se debe a que los residuos ácidos son repelidos por el SDS con carga negativa, lo que conduce a una relación masa-carga y migración inexactas. [8] Además, es posible que diferentes preparaciones de material genético no migren de forma consistente entre sí, por razones morfológicas o de otro tipo.

Tipos de gel

Los tipos de gel más utilizados son los de agarosa y los de poliacrilamida. Cada tipo de gel es adecuado para diferentes tipos y tamaños de analito. Los geles de poliacrilamida se utilizan normalmente para proteínas y tienen un poder de resolución muy alto para fragmentos pequeños de ADN (5-500 pb). Los geles de agarosa, por otro lado, tienen un poder de resolución menor para el ADN pero tienen un mayor rango de separación y, por lo tanto, se utilizan para fragmentos de ADN de un tamaño habitual de 50-20.000 pb, pero la resolución de más de 6 Mb es posible con la electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE). [9] Los geles de poliacrilamida se utilizan en una configuración vertical, mientras que los geles de agarosa se utilizan normalmente en horizontal en un modo submarino. También difieren en su metodología de fundición, ya que la agarosa se fija térmicamente, mientras que la poliacrilamida se forma en una reacción de polimerización química.

Agarosa

Inserción del peine de gel en una cámara de electroforesis en gel de agarosa

Los geles de agarosa se elaboran a partir de polímeros polisacáridos naturales extraídos de algas marinas . Los geles de agarosa se moldean y manipulan con mayor facilidad en comparación con otras matrices, ya que la configuración del gel es un cambio físico en lugar de químico. Las muestras también se recuperan fácilmente. Una vez finalizado el experimento, el gel resultante se puede almacenar en una bolsa de plástico en un refrigerador.

Los geles de agarosa no tienen un tamaño de poro uniforme, pero son óptimos para la electroforesis de proteínas que son mayores de 200 kDa. [10] La electroforesis en gel de agarosa también se puede utilizar para la separación de fragmentos de ADN que van desde 50 pares de bases hasta varias megabases (millones de bases), [11] los más grandes de los cuales requieren un aparato especializado. La distancia entre las bandas de ADN de diferentes longitudes está influenciada por el porcentaje de agarosa en el gel, y los porcentajes más altos requieren tiempos de ejecución más largos, a veces días. En cambio, los geles de agarosa de alto porcentaje deben ejecutarse con una electroforesis de campo pulsado (PFE) o electroforesis de inversión de campo.

"La mayoría de los geles de agarosa se preparan con entre un 0,7 % (buena separación o resolución de fragmentos grandes de ADN de 5 a 10 kb) y un 2 % (buena resolución para fragmentos pequeños de 0,2 a 1 kb) de agarosa disuelta en un tampón de electroforesis. Se puede utilizar hasta un 3 % para separar fragmentos muy pequeños, pero un gel de poliacrilamida vertical es más apropiado en este caso. Los geles de bajo porcentaje son muy débiles y pueden romperse al intentar levantarlos. Los geles de alto porcentaje suelen ser frágiles y no se solidifican de manera uniforme. Los geles de 1 % son comunes para muchas aplicaciones". [12]

Poliacrilamida

La electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) se utiliza para separar proteínas de un tamaño que va de 5 a 2000 kDa debido al tamaño de poro uniforme que proporciona el gel de poliacrilamida. El tamaño de poro se controla modulando las concentraciones de acrilamida y bisacrilamida en polvo utilizadas para crear un gel. Se debe tener cuidado al crear este tipo de gel, ya que la acrilamida es una potente neurotoxina en sus formas líquida y en polvo.

Las técnicas tradicionales de secuenciación de ADN, como los métodos Maxam-Gilbert o Sanger, utilizaban geles de poliacrilamida para separar fragmentos de ADN que diferían en longitud en un solo par de bases, de modo que se pudiera leer la secuencia. La mayoría de los métodos de separación de ADN modernos utilizan geles de agarosa, excepto para fragmentos de ADN particularmente pequeños. En la actualidad, se utiliza con mayor frecuencia en el campo de la inmunología y el análisis de proteínas, y a menudo se utiliza para separar diferentes proteínas o isoformas de la misma proteína en bandas separadas. Estas se pueden transferir a una membrana de nitrocelulosa o PVDF para analizarlas con anticuerpos y marcadores correspondientes, como en un Western blot .

Los geles de resolución se fabrican normalmente al 6%, 8%, 10%, 12% o 15%. Se vierte un gel de apilamiento (5%) sobre el gel de resolución y se inserta un peine de gel (que forma los pocillos y define los carriles donde se colocarán las proteínas, el tampón de muestra y las escaleras). El porcentaje elegido depende del tamaño de la proteína que se desea identificar o sondear en la muestra. Cuanto menor sea el peso conocido, mayor será el porcentaje que se debe utilizar. Los cambios en el sistema de tampón del gel pueden ayudar a resolver aún más las proteínas de tamaños muy pequeños. [13]

Almidón

El almidón de patata parcialmente hidrolizado constituye otro medio no tóxico para la electroforesis de proteínas. Los geles son ligeramente más opacos que la acrilamida o la agarosa. Las proteínas no desnaturalizadas se pueden separar según la carga y el tamaño. Se visualizan utilizando tinción con negro de naftal o negro de amido. Las concentraciones típicas de gel de almidón son del 5 % al 10 %. [14] [15] [16]

Condiciones del gel

Desnaturalizante

Perfiles TTGE que representan la diversidad de bifidobacterias en muestras fecales de dos voluntarios sanos (A y B) antes y después del tratamiento con AMC (Amoxicilina-Ácido Clavulánico Oral)

Los geles desnaturalizantes se utilizan en condiciones que alteran la estructura natural del analito, lo que hace que se despliegue en una cadena lineal. Por lo tanto, la movilidad de cada macromolécula depende únicamente de su longitud lineal y de su relación masa-carga. De este modo, se alteran los niveles secundario, terciario y cuaternario de la estructura biomolecular , dejando solo la estructura primaria para analizar.

Los ácidos nucleicos se desnaturalizan a menudo incluyendo urea en el tampón, mientras que las proteínas se desnaturalizan utilizando dodecil sulfato de sodio , normalmente como parte del proceso SDS-PAGE . Para la desnaturalización completa de las proteínas, también es necesario reducir los enlaces disulfuro covalentes que estabilizan su estructura terciaria y cuaternaria , un método llamado PAGE reductora. Las condiciones reductoras suelen mantenerse mediante la adición de beta-mercaptoetanol o ditiotreitol . Para un análisis general de muestras de proteínas, la PAGE reductora es la forma más común de electroforesis de proteínas .

Las condiciones desnaturalizantes son necesarias para una estimación adecuada del peso molecular del ARN. El ARN es capaz de formar más interacciones intramoleculares que el ADN, lo que puede provocar un cambio en su movilidad electroforética . La urea , el DMSO y el glioxal son los agentes desnaturalizantes más utilizados para alterar la estructura del ARN. Originalmente, el hidróxido de metilmercurio, altamente tóxico , se utilizaba a menudo en la electroforesis de ARN desnaturalizante, [17] pero puede ser el método de elección para algunas muestras. [18]

La electroforesis en gel desnaturalizante se utiliza en los métodos basados ​​en patrones de bandas de ADN y ARN, electroforesis en gel con gradiente de temperatura (TGGE) [19] y electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE). [20]

Nativo

Tinción específica ligada a enzimas: isoenzimas de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa en glóbulos rojos infectados por Plasmodium falciparum [21]

Los geles nativos se procesan en condiciones no desnaturalizantes para mantener la estructura natural del analito. Esto permite que el tamaño físico del complejo plegado o ensamblado afecte la movilidad, lo que permite el análisis de los cuatro niveles de la estructura biomolecular. Para las muestras biológicas, los detergentes se utilizan solo en la medida en que son necesarios para lisar las membranas lipídicas en la célula . Los complejos permanecen, en su mayor parte, asociados y plegados como lo estarían en la célula. Sin embargo, una desventaja es que los complejos pueden no separarse de manera limpia o predecible, ya que es difícil predecir cómo la forma y el tamaño de la molécula afectarán su movilidad. Abordar y resolver este problema es un objetivo principal de la PAGE nativa preparativa .

A diferencia de los métodos de desnaturalización, la electroforesis en gel nativo no utiliza un agente desnaturalizante cargado . Por lo tanto, las moléculas que se separan (generalmente proteínas o ácidos nucleicos ) difieren no solo en masa molecular y carga intrínseca, sino también en área de sección transversal y, por lo tanto, experimentan diferentes fuerzas electroforéticas que dependen de la forma de la estructura general. En el caso de las proteínas, dado que permanecen en el estado nativo, se pueden visualizar no solo mediante reactivos de tinción de proteínas generales, sino también mediante tinción específica ligada a enzimas.

Un ejemplo experimental específico de una aplicación de la electroforesis en gel nativo es comprobar la actividad enzimática para verificar la presencia de la enzima en la muestra durante la purificación de proteínas. Por ejemplo, para la proteína fosfatasa alcalina, la solución de tinción es una mezcla de sal de 4-cloro-2-2-metilbencenodiazonio con ácido 3-fosfo-2-naftoico-2'-4'-dimetilanilina en tampón Tris. Esta tinción se vende comercialmente como un kit para teñir geles. Si la proteína está presente, el mecanismo de la reacción tiene lugar en el siguiente orden: comienza con la desfosforilación del ácido 3-fosfo-2-naftoico-2'-4'-dimetilanilina por la fosfatasa alcalina (se necesita agua para la reacción). El grupo fosfato se libera y se reemplaza por un grupo alcohol del agua. El electrófilo 4-cloro-2-2-metilbencenodiazonio (sal de diazonio Fast Red TR) desplaza el grupo alcohol formando el producto final, el colorante azo rojo. Como su nombre lo indica, este es el producto final rojo visible de la reacción. En la experimentación académica de pregrado sobre la purificación de proteínas, el gel generalmente se ejecuta junto con muestras comerciales purificadas para visualizar los resultados y concluir si la purificación fue exitosa o no. [22]

La electroforesis en gel nativa se utiliza normalmente en proteómica y metalómica . Sin embargo, la electroforesis en gel nativa también se utiliza para escanear genes (ADN) en busca de mutaciones desconocidas, como en el caso del polimorfismo de conformación monocatenario .

Buffers

Los tampones en la electroforesis en gel se utilizan para proporcionar iones que transportan una corriente y para mantener el pH a un valor relativamente constante. Estos tampones tienen muchos iones en ellos, lo que es necesario para el paso de electricidad a través de ellos. Algo como el agua destilada o el benceno contiene pocos iones, lo que no es ideal para el uso en electroforesis. [23] Hay una serie de tampones utilizados para la electroforesis. Los más comunes son, para los ácidos nucleicos Tris/Acetato/EDTA (TAE), Tris/Borato/EDTA (TBE). Se han propuesto muchos otros tampones, por ejemplo, el borato de litio , que rara vez se utiliza, según las citas de Pubmed (LB), la histidina isoeléctrica, los tampones de productos con pK coincidentes, etc.; en la mayoría de los casos, la supuesta justificación es una menor movilidad de iones coincidentes con la corriente (menos calor), lo que conduce a una mayor vida útil del tampón. El borato es problemático; el borato puede polimerizar o interactuar con dioles cis como los que se encuentran en el ARN. La TAE tiene la capacidad de amortiguación más baja, pero proporciona la mejor resolución para ADN más grande. Esto significa un voltaje más bajo y más tiempo, pero un mejor producto. La LB es relativamente nueva y no es efectiva para resolver fragmentos mayores a 5 kbp; sin embargo, con su baja conductividad, se podría utilizar un voltaje mucho más alto (hasta 35 V/cm), lo que significa un tiempo de análisis más corto para la electroforesis de rutina. Una diferencia de tamaño de tan solo un par de bases podría resolverse en un gel de agarosa al 3% con un medio de conductividad extremadamente baja (borato de litio 1 mM). [24]

La mayoría de las separaciones de proteínas mediante electroforesis en gel por electroforesis en gel SDS-PAGE se realizan utilizando un sistema de tampón "discontinuo" (o DISC) que mejora significativamente la nitidez de las bandas dentro del gel. Durante la electroforesis en un sistema de gel discontinuo, se forma un gradiente iónico en la etapa inicial de la electroforesis que hace que todas las proteínas se concentren en una única banda nítida en un proceso llamado isotacoforesis . La separación de las proteínas por tamaño se logra en la región inferior, "de resolución" del gel. El gel de resolución normalmente tiene un tamaño de poro mucho más pequeño, lo que produce un efecto de tamizado que ahora determina la movilidad electroforética de las proteínas.

Visualización

Una vez finalizada la electroforesis, las moléculas del gel se pueden teñir para hacerlas visibles. El ADN se puede visualizar utilizando bromuro de etidio que, cuando se intercala en el ADN, emite fluorescencia bajo luz ultravioleta , mientras que las proteínas se pueden visualizar utilizando tinción de plata o colorante azul brillante de Coomassie . También se pueden utilizar otros métodos para visualizar la separación de los componentes de la mezcla en el gel. Si las moléculas que se van a separar contienen radiactividad , por ejemplo en un gel de secuenciación de ADN , se puede registrar un autorradiograma del gel. Se pueden tomar fotografías de los geles, a menudo utilizando un sistema Gel Doc . Los geles suelen etiquetarse para su presentación y registros científicos en el popular sitio web de creación de figuras, SciUGo.

Procesamiento posterior

Después de la separación, se puede utilizar un método de separación adicional, como el enfoque isoeléctrico o SDS-PAGE . A continuación, se cortará físicamente el gel y se extraerán los complejos proteicos de cada porción por separado. A continuación, se puede analizar cada extracto, por ejemplo, mediante la identificación de la masa de los péptidos o la secuenciación de péptidos de novo después de la digestión en gel . Esto puede proporcionar una gran cantidad de información sobre las identidades de las proteínas en un complejo.

Aplicaciones

La electroforesis en gel se utiliza en medicina forense , biología molecular , genética , microbiología y bioquímica . Los resultados se pueden analizar cuantitativamente visualizando el gel con luz ultravioleta y un dispositivo de obtención de imágenes en gel. La imagen se registra con una cámara operada por computadora y se mide la intensidad de la banda o punto de interés y se compara con el estándar o los marcadores cargados en el mismo gel. La medición y el análisis se realizan principalmente con software especializado.

Dependiendo del tipo de análisis que se realice, a menudo se implementan otras técnicas junto con los resultados de la electroforesis en gel, lo que proporciona una amplia gama de aplicaciones específicas de campo.

Ácidos nucleicos

Un gel de agarosa de un producto de PCR comparado con una escalera de ADN.

En el caso de los ácidos nucleicos, la dirección de la migración, desde electrodos negativos a positivos, se debe a la carga negativa natural que lleva su cadena principal de azúcar y fosfato . [25]

Los fragmentos de ADN de doble cadena se comportan naturalmente como varillas largas, por lo que su migración a través del gel es relativa a su tamaño o, para fragmentos cíclicos, a su radio de giro . Sin embargo, el ADN circular, como los plásmidos , puede mostrar múltiples bandas; la velocidad de migración puede depender de si está relajado o superenrollado. El ADN o ARN monocatenario tiende a plegarse en moléculas con formas complejas y migrar a través del gel de una manera complicada en función de su estructura terciaria. Por lo tanto, se utilizan agentes que alteran los enlaces de hidrógeno , como el hidróxido de sodio o la formamida , para desnaturalizar los ácidos nucleicos y hacer que se comporten nuevamente como varillas largas. [26]

La electroforesis en gel de ADN o ARN de gran tamaño se realiza habitualmente mediante electroforesis en gel de agarosa. Consulte la página " método de terminación de cadena " para ver un ejemplo de un gel de secuenciación de ADN de poliacrilamida. La caracterización a través de la interacción de ligandos de ácidos nucleicos o fragmentos se puede realizar mediante electroforesis de afinidad por desplazamiento de movilidad .

La electroforesis de muestras de ARN se puede utilizar para comprobar la contaminación del ADN genómico y también la degradación del ARN. El ARN de organismos eucariotas muestra bandas diferenciadas de ARNr 28s y 18s, siendo la banda 28s aproximadamente el doble de intensa que la banda 18s. El ARN degradado tiene bandas menos definidas, tiene un aspecto manchado y la relación de intensidad es inferior a 2:1.

Proteínas

Autorradiografía SDS-PAGE : Las proteínas indicadas están presentes en diferentes concentraciones en las dos muestras.

Las proteínas , a diferencia de los ácidos nucleicos, pueden tener cargas variables y formas complejas, por lo tanto, es posible que no migren al gel de poliacrilamida a velocidades similares, o todas al colocar un campo electromagnético negativo a positivo en la muestra. Por lo tanto, las proteínas generalmente se desnaturalizan en presencia de un detergente como el dodecil sulfato de sodio (SDS) que recubre las proteínas con una carga negativa. [3] Generalmente, la cantidad de SDS unido es relativa al tamaño de la proteína (generalmente 1,4 g de SDS por gramo de proteína), de modo que las proteínas desnaturalizadas resultantes tienen una carga negativa general y todas las proteínas tienen una relación carga-masa similar. Dado que las proteínas desnaturalizadas actúan como varillas largas en lugar de tener una forma terciaria compleja, la velocidad a la que las proteínas recubiertas de SDS resultantes migran en el gel es relativa solo a su tamaño y no a su carga o forma. [3]

Las proteínas generalmente se analizan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio ( SDS-PAGE ), mediante electroforesis en gel nativo , mediante electroforesis en gel nativo preparativa ( QPNC-PAGE ) o mediante electroforesis 2-D .

La caracterización a través de la interacción del ligando se puede realizar mediante electrotransferencia o mediante electroforesis de afinidad en agarosa o mediante electroforesis capilar para la estimación de constantes de unión y la determinación de características estructurales como el contenido de glicanos a través de la unión de lectinas .

Nanopartículas

Una nueva aplicación de la electroforesis en gel es la separación o caracterización de nanopartículas de metal u óxido de metal (por ejemplo, Au, Ag, ZnO, SiO2) en cuanto al tamaño, la forma o la química de la superficie de las nanopartículas. [27] El objetivo es obtener una muestra más homogénea (por ejemplo, una distribución más estrecha del tamaño de las partículas), que luego se puede utilizar en otros productos o procesos (por ejemplo, procesos de autoensamblaje). Para la separación de nanopartículas dentro de un gel, el parámetro clave es la relación entre el tamaño de las partículas y el tamaño de la malla, por lo que se identificaron dos mecanismos de migración: el mecanismo sin restricciones, en el que el tamaño de las partículas << el tamaño de la malla, y el mecanismo restringido, en el que el tamaño de las partículas es similar al tamaño de la malla. [28]

Historia

Un libro de 1959 sobre electroforesis escrito por Milan Bier cita referencias del siglo XIX. [33] Sin embargo, Oliver Smithies hizo contribuciones significativas. Bier afirma: "El método de Smithies... está encontrando una amplia aplicación debido a su poder de separación único". Tomado en contexto, Bier claramente implica que el método de Smithies es una mejora.

Véase también

Referencias

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Wikimedia Commons tiene medios relacionados con Electroforesis en gel .
  • Demostración de electroforesis en el laboratorio de biotecnología, del Centro de aprendizaje de ciencias genéticas de la Universidad de Utah
  • Electroforesis discontinua en gel de proteínas nativas
  • Electroforesis con pajita para beber
  • Cómo ejecutar un gel de ADN o ARN
  • Animación del análisis en gel de la restricción de ADN.
  • Fotos paso a paso de la ejecución de un gel y la extracción de ADN.
  • Un método típico de la wikiversidad
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