Mapa de restricciones

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Un mapa de restricción es un mapa de sitios de restricción conocidos dentro de una secuencia de ADN . El mapeo de restricción requiere el uso de enzimas de restricción . En biología molecular , los mapas de restricción se utilizan como referencia para diseñar plásmidos u otros fragmentos relativamente cortos de ADN, y a veces para ADN genómico más largo. Existen otras formas de mapear características en el ADN para moléculas de ADN de mayor longitud, como el mapeo por transducción . ^[1]

Un enfoque para construir un mapa de restricción de una molécula de ADN es secuenciar toda la molécula y ejecutar la secuencia a través de un programa de computadora que encontrará los sitios de reconocimiento presentes para cada enzima de restricción conocida.

Antes de que se automatizara la secuenciación, habría sido prohibitivamente costoso secuenciar una cadena de ADN completa. Para encontrar las posiciones relativas de los sitios de restricción en un plásmido, se utiliza una técnica que implica digestos de restricción simple y doble. En función de los tamaños de los fragmentos de ADN resultantes, se pueden inferir las posiciones de los sitios. El mapeo de restricción es una técnica muy útil cuando se utiliza para determinar la orientación de un inserto en un vector de clonación, al mapear la posición de un sitio de restricción descentrado en el inserto. ^[2]

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El procedimiento experimental requiere primero una muestra de ADN plasmídico purificado para cada digestión que se va a realizar. A continuación, se realiza la digestión con cada enzima elegida. Las muestras resultantes se analizan posteriormente en un gel de electroforesis , normalmente en gel de agarosa .

El primer paso después de completar la electroforesis es sumar los tamaños de los fragmentos en cada carril. La suma de los fragmentos individuales debe ser igual al tamaño del fragmento original, y los fragmentos de cada digestión también deben sumar el mismo tamaño entre sí. Si los tamaños de los fragmentos no suman correctamente, es probable que surjan dos problemas. En un caso, algunos de los fragmentos más pequeños pueden haberse salido del extremo del gel. Esto ocurre con frecuencia si el gel se deja correr demasiado tiempo. Una segunda fuente posible de error es que el gel no era lo suficientemente denso y, por lo tanto, no pudo resolver fragmentos de tamaño cercano. Esto conduce a una falta de separación de fragmentos que eran de tamaño cercano. Si todas las digestiones producen fragmentos que suman, se puede inferir la posición de los sitios REN (endonucleasa de restricción) colocándolos en puntos del fragmento de ADN original que satisfagan los tamaños de fragmento producidos por las tres digestiones.

En esta técnica, las células se lisan en condiciones alcalinas. El ADN de la mezcla se desnaturaliza (se separan las hebras) rompiendo los enlaces de hidrógeno entre las dos hebras. El ADN genómico grande se enreda y permanece desnaturalizado cuando se reduce el pH durante la neutralización. En otras palabras, las hebras se vuelven a unir de forma desordenada, apareándose las bases de forma aleatoria. Las hebras de los plásmidos superenrollados circulares permanecerán relativamente alineadas y se renaturalizarán correctamente. Por lo tanto, el ADN genómico formará un agregado insoluble y los plásmidos superenrollados quedarán en solución. A esto se puede seguir con la extracción con fenol para eliminar las proteínas y otras moléculas. A continuación, el ADN se puede someter a una precipitación con etanol para concentrar la muestra.

• Vector NTI , software bioinformático utilizado, entre otras cosas, para predecir sitios de restricción en un vector de ADN
• RFLP , método utilizado para diferenciar genomas extremadamente similares, entre otras cosas