Fagos Ff

Los fagos Ff ( fagos filamentosos específicos de F ) son un grupo de fagos filamentosos casi idénticos (género Inovirus ) que incluyen los fagos f1 , fd, M13 y ZJ/2, que infectan bacterias que portan el factor de fertilidad F. [ ^{1] [2] [3] [4] [5] [6] [7]} El virión (partícula viral) es un filamento flexible que mide aproximadamente 6 por 900 nm, que comprende un tubo proteico cilíndrico que protege una molécula de ADN circular monocatenaria en su núcleo. El fago codifica solo 11 productos genéticos y es uno de los virus más simples conocidos. Se ha utilizado ampliamente para estudiar aspectos fundamentales de la biología molecular. George Smith y Greg Winter utilizaron f1 y fd para su trabajo sobre la visualización de fagos , por el que recibieron una parte del Premio Nobel de Química de 2018 . ^[8] Los primeros experimentos con fagos Ff utilizaron M13 para identificar funciones genéticas, ^{[9] [10]} y M13 también se desarrolló como vehículo de clonación, ^[11] por lo que el nombre M13 a veces se utiliza como sinónimo informal para todo el grupo de fagos Ff.

El virión es un filamento flexible ( cadena similar a un gusano ) de unos 6 nm de diámetro y 900 nm de longitud. Varios miles de copias de una pequeña (50 residuos de aminoácidos) subunidad de proteína de cubierta principal alfa-helicoidal alargada (el producto del gen 8, o p8) en una disposición superpuesta similar a una teja forman un cilindro hueco que encierra el genoma de ADN monocatenario circular. Cada subunidad p8 tiene una colección de residuos básicos cerca del extremo C de la proteína alargada y residuos ácidos cerca del extremo N; estas dos regiones están separadas por unos 20 residuos hidrófobos (no polares). La disposición similar a una teja coloca los residuos ácidos de p8 cerca de la superficie exterior del cilindro, donde hacen que la partícula del virus esté cargada negativamente; regiones no polares cerca de regiones no polares de subunidades p8 vecinas, donde las interacciones no polares contribuyen a una notable estabilidad física de la partícula del virus; y residuos básicos cerca del centro del cilindro, donde interactúan con los fosfatos de ADN cargados negativamente en el núcleo del virión. Las moléculas de ADN más largas ^[12] (o más cortas ^[13] ) se pueden empaquetar, ya que se pueden agregar más (o menos) subunidades p8 durante el ensamblaje según sea necesario para proteger el ADN, lo que hace que el fago sea útil para estudios genéticos. (Este efecto no debe confundirse con el polifago , que puede empaquetar varias moléculas de ADN separadas y distintas). Aproximadamente 5 copias de cada una de las cuatro proteínas menores tapan los dos extremos del virión. ^[14]

La estructura molecular de la cápside del virión (el ensamblaje de las proteínas de la subunidad p8) se ha determinado mediante difracción de rayos X en fibras y se han depositado modelos estructurales en el Protein Data Bank . En particular, la serie de estructuras de los viriones fd y Pf1 depositadas en el PDB a lo largo de décadas ilustra las mejoras en los métodos de recopilación de datos de difracción de fibras y análisis computacional. Las estructuras de la proteína de la cápside p3 y la proteína de replicación/ensamblaje p5 también se han determinado mediante cristalografía de rayos X y se han depositado en el PDB. ^{[ cita requerida ]}

La secuencia de ADN del genoma fd tiene 6408 nucleótidos que comprenden 9 genes, pero el genoma tiene 11 marcos de lectura abiertos que producen 11 proteínas, ya que dos genes, el gen 2 y el gen 1, tienen inicios de traducción internos en marco, generando dos proteínas adicionales, p10 y p11. El genoma también contiene una secuencia intergénica corta no codificante. ^[15] Las secuencias M13 y f1 son ligeramente diferentes de fd. Ambas tienen solo 6407 nucleótidos; f1 difiere de fd en 180 posiciones (solo 10 de estos cambios se reflejan en cambios de aminoácidos en productos génicos) ^[16] y M13 tiene solo 59 diferencias de nucleótidos con f1. Para muchos propósitos, los fagos en el grupo Ff pueden considerarse intercambiables.

Cinco productos génicos forman parte del virión: la proteína principal de la cubierta (p8) y las proteínas secundarias que cubren los dos extremos, p3 y p6 en un extremo, y p7 y p9 en el otro extremo. Tres productos génicos (p2, p5 y p10) son proteínas citoplasmáticas necesarias para la síntesis de ADN y el resto son proteínas de membrana involucradas en el ensamblaje del virión. ^[17]

Inovirus
Clasificación de virus
(sin clasificar):	Virus
Reino :	Monodnaviria
Reino:	Loebvirae
Filo:	Hofneiviricota
Clase:	Ficha técnica
Orden:	Virus tubulocíticos
Familia:	Inovirus
Género:	Inovirus

El gen que codifica p1 se ha utilizado como gen marcador conservado, junto con otras tres características específicas de los genomas de inovirus, en un enfoque de aprendizaje automático para identificar más de 10 000 secuencias similares a inovirus a partir de genomas microbianos. ^[18]

La proteína p3 está anclada a un extremo del virión por el dominio C-terminal de p3. La infección de las bacterias hospedadoras implica la interacción de dos regiones N-terminales diferentes de p3 con dos sitios diferentes de las bacterias hospedadoras. Primero, el dominio N2 de p3 se une a la punta externa del pilus F , y el pilus se retrae dentro de la célula. Esta retracción puede implicar la despolimerización del ensamblaje de subunidades del pilus en la membrana celular en la base del pilus por una inversión del proceso de crecimiento y polimerización del pilus. ^{[1] [19] [20]} A medida que la punta del pilus que lleva p3 se acerca a la pared celular, el dominio N1 de p3 interactúa con la proteína bacteriana TolQRA para completar la infección y liberar el genoma en el citoplasma del hospedador. ^{[21] [22]}

Una vez que el ADN viral monocatenario ingresa al citoplasma, sirve como plantilla para la síntesis de una cadena complementaria de ADN. Esta síntesis se inicia en la región intergénica de la secuencia de ADN por la ARN polimerasa del huésped, que sintetiza un cebador de ARN corto en el ADN infectante como plantilla. La ADN polimerasa III del huésped utiliza luego este cebador para sintetizar la cadena complementaria completa de ADN, lo que produce un círculo de doble cadena, a veces llamado ADN de forma replicativa (RF). La cadena complementaria de la RF es la plantilla de transcripción para las proteínas codificadas por fagos, especialmente p2 y p10, que son necesarias para una mayor replicación del ADN. ^{[ cita requerida ]}

La proteína p2 corta la hebra viral del ADN de RF y la ADN polimerasa III del huésped sintetiza una nueva hebra viral. La hebra viral antigua se desplaza a medida que se sintetiza la nueva. Cuando se completa un círculo, la p2 unida covalentemente corta la hebra viral desplazada en la unión entre el ADN antiguo y el recién sintetizado y vuelve a ligar los dos extremos y libera p2. RF se replica mediante este mecanismo de círculo rodante para generar docenas de copias de RF. ^{[ cita requerida ]}

Cuando la concentración de proteínas del fago ha aumentado, las nuevas cadenas virales están recubiertas por la proteína de replicación/ensamblaje p5 en lugar de por las cadenas de ADN complementarias. La p5 también inhibe la traducción de p2, de modo que la producción y el empaquetamiento de ssADN viral de la progenie están sincronizados. ^[6]

La infección no mata a la bacteria huésped, ^[23] a diferencia de la mayoría de las otras familias de fagos. Los fagos de la progenie se ensamblan a medida que se extruyen a través de la membrana de las bacterias en crecimiento, probablemente en los sitios de adhesión que unen las membranas interna y externa. Las cinco proteínas del fago que forman la capa del fago completo ingresan a la membrana interna; para p8 y p3, las secuencias líder N-terminales (que luego se eliminan) ayudan a las proteínas a ingresar a la membrana bacteriana, con sus N-terminales dirigidos lejos del citoplasma hacia el periplasma. Otras tres proteínas de membrana del fago que no están presentes en el fago, p1, p11 y p4, también participan en el ensamblaje. La replicación del ADN RF se convierte en producción de ssDNA del fago al recubrir el ADN con p5 para formar un complejo de replicación/ensamblaje p5/ADN alargado, que luego interactúa con las proteínas del fago unidas a la membrana. El proceso de extrusión recoge las proteínas p7 y p9 que forman la punta externa del fago progenie. A medida que el p5 se separa del ADN, el ADN progenie se extruye a través de la membrana y se envuelve en una envoltura helicoidal de p8, a la que se añaden p3 y p6 al final del ensamblaje. La proteína p4 puede formar un poro de extrusión en la membrana externa. ^[14]

La interacción de la señal de empaquetamiento de ADN de doble cadena con el complejo p1-tiorredoxina en la membrana interna del huésped desencadena la formación de un poro. La proteína p1 contiene motivos Walker que son esenciales para el ensamblaje del fago, ^[24] lo que sugiere que p1 es un motor molecular involucrado en el ensamblaje del fago. La proteína p1 tiene un dominio hidrofóbico que abarca la membrana con la porción N-terminal en el citoplasma y la porción C-terminal en el periplasma (la orientación inversa de p8). Adyacente al lado citoplasmático del dominio que abarca la membrana hay una secuencia de 13 residuos de p1 que tiene un patrón de residuos básicos que coincide estrechamente con el patrón de residuos básicos cerca del extremo C de p8, pero invertido con respecto a esa secuencia. ^[25]

Se pueden generar conjuntos intermedios de p8 tratando el fago con cloroformo. ^{[26] [27] [28]} El contenido helicoidal de p8 en estas formas intermedias es similar al del fago, lo que sugiere que el cambio estructural durante el ensamblaje puede implicar solo un deslizamiento de las subunidades p8 en tejas con respecto a sus vecinas en el ensamblaje. ^{[29] [30]}

Los fagos Ff han sido diseñados para aplicaciones en ciencias biológicas y médicas. Muchas aplicaciones se basan en experimentos ^[12] que muestran que la secuencia de ADN que determina la resistencia al antibiótico kanamicina se puede insertar en una forma funcional en la secuencia intergénica no codificante del ADN del fago fd. Dichos fagos modificados son correspondientemente más largos que el fd filamentoso de tipo salvaje, porque el ADN más largo está recubierto con una cantidad correspondientemente mayor de proteínas de la cubierta del gen 8, pero el ciclo de vida del fago no se altera de ninguna otra manera. Por otro lado, el fago tradicional de forma “renacuajo” o isométrica, que tiene una cápside de tamaño limitado, no se puede utilizar tan fácilmente para encapsidar una molécula de ADN más grande. El fago modificado se puede seleccionar infectando bacterias sensibles a la kanamicina con fagos modificados para introducir resistencia a la kanamicina y cultivando las bacterias infectadas en medios que contienen una concentración de kanamicina que de otro modo sería letal. ^{[ cita requerida ]}

Este resultado se amplió insertando ADN extraño que expresa un péptido extraño en el gen 3 del fago fd, en lugar de en la secuencia intergénica, de modo que el péptido extraño aparece en la superficie del fago como parte de la proteína de adsorción del gen 3. ^{[31] [32] [33]} El fago que porta el péptido extraño puede detectarse entonces utilizando los anticuerpos apropiados. El reverso de este enfoque es insertar ADN que codifica anticuerpos en el gen 3 y detectar su presencia mediante antígenos apropiados. ^[34]

Estas técnicas se han ampliado a lo largo de los años de muchas maneras, por ejemplo, insertando ADN extraño en los genes que codifican proteínas de la cubierta de fagos distintas del gen 3, y/o duplicando el gen de interés para modificar solo algunos de los productos génicos correspondientes. La tecnología de visualización de fagos se ha utilizado ampliamente para muchos fines. ^{[35] [36] [37]}

Los fagos Ff han sido diseñados para aplicaciones tales como dispositivos de remediación, electroquímicos, fotovoltaicos, catalíticos, de detección y de memoria digital, especialmente por Angela Belcher y sus colegas. ^{[6] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [ citas excesivas ]}

• Bacteriófago filamentoso

• Zona Viral
• ATCC-Factor de desarrollo
• Avión ATCC M13