Disrupción celular

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La disrupción celular , a veces denominada digestión , es un método o proceso para liberar moléculas biológicas del interior de una célula .

La producción de moléculas de interés biológico mediante métodos de clonación y cultivo permite el estudio y la fabricación de moléculas relevantes. A excepción de las moléculas excretadas, las células que producen moléculas de interés deben ser desorganizadas. En esta página se analizan varios métodos. Otro método de desorganización se denomina destechamiento celular .

Un método mecánico común a escala de laboratorio para la disrupción celular utiliza perlas de vidrio , cerámica o acero , de 0,1 a 2 mm (0,004 a 0,08 pulgadas) de diámetro, mezcladas con una muestra suspendida en una solución acuosa . Desarrollado por primera vez por Tim Hopkins a fines de la década de 1970, la mezcla de muestra y perlas se somete a una agitación de alto nivel revolviendo o agitando. Las perlas chocan con la muestra celular, abriendo la célula para liberar los componentes intracelulares . A diferencia de otros métodos, el cizallamiento mecánico es moderado durante la homogeneización, lo que da como resultado excelentes preparaciones de membrana o subcelulares. El método, a menudo llamado "batido de perlas", funciona bien para todo tipo de material celular, desde esporas hasta tejidos animales y vegetales . Es el método más utilizado de lisis de levadura y puede producir una rotura de más del 50% (hasta el 95%). ^[1] Tiene la ventaja sobre otros métodos mecánicos de disrupción celular de poder disrumpir tamaños de muestra muy pequeños, procesar muchas muestras a la vez sin preocupaciones de contaminación cruzada y no libera aerosoles potencialmente dañinos en el proceso.

En el ejemplo más simple del método, se agrega un volumen igual de perlas a una suspensión de células o tejido en un tubo de ensayo y la muestra se mezcla vigorosamente en un mezclador vórtex común de laboratorio . Si bien los tiempos de procesamiento son lentos, demorando entre 3 y 10 veces más que en las máquinas de agitación especiales , funciona bien para células que se rompen fácilmente y es económico.

El éxito del batido de perlas depende no solo de las características de diseño de la máquina agitadora (que tienen en cuenta la frecuencia de oscilación de la agitación, el alcance o la distancia de la agitación, la orientación de la agitación y la orientación del vial), sino también de la selección del tamaño de perlas correcto (0,1–6 mm (0,004–0,2 pulgadas) de diámetro), la composición de las perlas (vidrio, cerámica, acero) y la carga de perlas en el vial .

En la mayoría de los laboratorios, el batido de perlas se realiza en lotes de uno a veinticuatro viales de plástico sellados o tubos de centrífuga . La muestra y las pequeñas perlas se agitan a aproximadamente 2000 oscilaciones por minuto en agitadores alternativos especialmente diseñados impulsados ​​por motores eléctricos de alta potencia . La disrupción celular se completa en 1 a 3 minutos de agitación. Se logran velocidades significativamente más rápidas de disrupción celular con una variación del batidor de perlas llamado SoniBeast . A diferencia de las máquinas convencionales, agita las perlas utilizando un movimiento de vórtice a 20.000 oscilaciones por minuto. Las máquinas batidoras de perlas más grandes que sostienen microplacas de pocillos profundos también acortan los tiempos de proceso, al igual que los dispensadores de perlas diseñados para cargar rápidamente las perlas en múltiples viales o microplacas. ^{[2] [3]} También están disponibles viales y microplacas precargados.

Todas las máquinas de batido de perlas de alta energía calientan la muestra aproximadamente 10 grados por minuto. Esto se debe a las colisiones por fricción de las perlas durante la homogeneización. El enfriamiento de la muestra durante o después del batido de perlas puede ser necesario para evitar daños a las proteínas sensibles al calor, como las enzimas. El calentamiento de la muestra se puede controlar mediante el batido de perlas durante intervalos de tiempo cortos con enfriamiento en hielo entre cada intervalo, procesando viales en portaviales de aluminio previamente enfriados o haciendo circular refrigerante gaseoso a través de la máquina durante el batido de perlas.

Una configuración diferente de batidor de perlas, adecuada para volúmenes de muestra mayores, utiliza un rotor de fluorocarbono giratorio dentro de una cámara de 15, 50 o 200 ml para agitar las perlas. En esta configuración, la cámara puede estar rodeada por una camisa de enfriamiento estático. Utilizando esta misma configuración de rotor/cámara, existen máquinas comerciales grandes para procesar muchos litros de suspensión celular . Actualmente, estas máquinas se limitan a procesar organismos unicelulares como levaduras, algas y bacterias .

Las muestras con una matriz extracelular resistente, como el tejido conectivo animal, algunas muestras de biopsias tumorales, tejido venoso, cartílago, semillas, etc., se reducen a un polvo fino mediante pulverización por impacto a temperaturas de nitrógeno líquido. Esta técnica, conocida como criopulverización, se basa en el hecho de que las muestras biológicas que contienen una fracción significativa de agua se vuelven quebradizas a temperaturas extremadamente frías. Esta técnica fue descrita por primera vez por Smucker y Pfister en 1975, quienes se refirieron a la técnica como crio-impacto. Los autores demostraron que las células se rompen de manera efectiva con este método, confirmando mediante microscopía de fases y electrónica que los planos de rotura atraviesan las paredes celulares y las membranas citoplasmáticas. ^[4]

La técnica se puede realizar utilizando un mortero enfriado a temperaturas de nitrógeno líquido, pero el uso de este aparato clásico es laborioso y la pérdida de muestras suele ser un problema. También se encuentran disponibles para este propósito pulverizadores especializados de acero inoxidable, conocidos genéricamente como pulverizadores de tejidos. Requieren menos esfuerzo manual, brindan una buena recuperación de muestras y son fáciles de limpiar entre muestras. Las ventajas de esta técnica son mayores rendimientos de proteínas y ácidos nucleicos a partir de muestras de tejido pequeñas y duras, especialmente cuando se utiliza como paso preliminar a los métodos de disrupción celular mecánicos o químicos/con solventes mencionados anteriormente.

Desde la década de 1940, la alta presión se ha utilizado como método de disrupción celular, sobre todo mediante la prensa celular de presión francesa , o prensa francesa para abreviar. Este método fue desarrollado por Charles Stacy French y utiliza alta presión para forzar a las células a pasar a través de un orificio estrecho, lo que hace que las células se lisen debido a las fuerzas de corte experimentadas a través del diferencial de presión. ^{[5] [6]} Si bien las prensas francesas se han convertido en un artículo básico en muchos laboratorios de microbiología, su producción se ha interrumpido en gran medida, lo que ha llevado a un resurgimiento de aplicaciones alternativas de tecnología similar.

Los disruptores celulares físicos modernos suelen funcionar mediante presión neumática o hidráulica. Aunque las máquinas neumáticas suelen tener un coste menor, su rendimiento puede ser poco fiable debido a las variaciones de la presión de procesamiento a lo largo de la carrera de la bomba de aire. En general, se considera que las máquinas hidráulicas ofrecen una capacidad de lisis superior, especialmente al procesar muestras más difíciles de romper, como levaduras o bacterias grampositivas , debido a su capacidad de mantener una presión constante durante toda la carrera del pistón. Como la prensa francesa, que funciona mediante presión hidráulica, es capaz de lisis de más del 90 % de los tipos de células más utilizados, a menudo se la considera el estándar de oro en cuanto a rendimiento de lisis y las máquinas modernas suelen compararse con ella no solo en términos de eficiencia de lisis sino también en términos de seguridad y facilidad de uso. Algunos fabricantes también están tratando de mejorar el diseño tradicional alterando propiedades dentro de estas máquinas distintas de la presión que impulsa la muestra a través del orificio. Un ejemplo de ello es Constant Systems, que ha demostrado recientemente que sus disruptores celulares no solo igualan el rendimiento de una prensa francesa tradicional, sino que también se esfuerzan por lograr los mismos resultados con una potencia mucho menor. ^[7]

Tecnología de ciclo de presión ("PCT"). La PCT es una plataforma tecnológica patentada que permite el uso de ciclos alternos de presión hidrostática entre niveles ambientales y ultraaltos (hasta 90 000 psi) para controlar de forma segura, cómoda y reproducible las acciones de las moléculas en muestras biológicas, por ejemplo, la ruptura (lisis) de células y tejidos de origen humano, animal, vegetal y microbiano, y la inactivación de patógenos. Los sistemas mejorados con PCT (instrumentos y consumibles) abordan algunos problemas complejos inherentes a la preparación de muestras biológicas. Las ventajas de la PCT incluyen: (a) extracción y recuperación de más proteínas de membrana, (b) digestión mejorada de proteínas, (c) lisis diferencial en una base de muestra mixta, (d) inactivación de patógenos, (e) mayor detección de ADN y (f) control exquisito del proceso de preparación de muestras. ^[8]

El método Microfluidizer utilizado para la disrupción celular influye fuertemente en las propiedades fisicoquímicas de la suspensión celular lisada , como el tamaño de partícula, la viscosidad, el rendimiento proteico y la actividad enzimática. En los últimos años, el método Microfluidizer ha ganado popularidad en la disrupción celular debido a su facilidad de uso y eficiencia en la disrupción de muchos tipos diferentes de células. La tecnología Microfluidizer fue licenciada por una empresa llamada Arthur D. Little y fue desarrollada y utilizada por primera vez en la década de 1980, inicialmente comenzando como una herramienta para la creación de liposomas . Desde entonces se ha utilizado en otras aplicaciones como nanoemulsiones de disrupción celular y reducción del tamaño de partículas sólidas, entre otras.

Mediante el uso de microcanales con geometría fija y una bomba intensificadora, se generan altas tasas de cizallamiento que rompen las células. Este método de lisis celular puede producir la rotura de más del 90% de las células de E. coli. ^[9]

Muchas proteínas son extremadamente sensibles a la temperatura y, en muchos casos, pueden comenzar a desnaturalizarse a temperaturas de tan solo 4 grados Celsius. Dentro de los microcanales, las temperaturas superan los 4 grados Celsius, pero la máquina está diseñada para enfriarse rápidamente, de modo que el tiempo en que las células están expuestas a temperaturas elevadas es extremadamente corto ( tiempo de residencia de 25 ms a 40 ms). Debido a este control efectivo de la temperatura, el microfluidizador produce niveles más altos de proteínas y enzimas activas que otros métodos mecánicos cuando las proteínas son sensibles a la temperatura. ^[10]

También se observan cambios de viscosidad con frecuencia cuando se rompen las células. Si la viscosidad de la suspensión celular es alta, puede dificultar bastante la manipulación posterior (como la filtración y el pipeteo preciso). Los cambios de viscosidad observados con un microfluidizador son relativamente bajos y disminuyen con más pasadas por la máquina. ^[11]

A diferencia de otros métodos de disrupción mecánica, el microfluidizador rompe las membranas celulares de manera eficiente pero suave, lo que da como resultado fragmentos de pared celular relativamente grandes (450 nm), lo que facilita la separación del contenido celular. Esto puede conducir a tiempos de filtración más cortos y una mejor separación por centrifugación. ^[12]

La tecnología de microfluidizadores escala desde un mililitro hasta miles de litros.

Para la descompresión con nitrógeno, primero se disuelven grandes cantidades de nitrógeno en la célula a alta presión dentro de un recipiente de presión adecuado . Luego, cuando la presión del gas se libera repentinamente, el nitrógeno sale de la solución en forma de burbujas en expansión que estiran las membranas de cada célula hasta que se rompen y liberan el contenido de la célula.

La descompresión de nitrógeno es más protectora de las enzimas y los orgánulos que los métodos de homogeneización ultrasónica y mecánica y se compara favorablemente con la acción disruptiva controlada obtenida en un homogeneizador de mortero y mano de vidrio y PTFE. ^[13] Mientras que otros métodos disruptivos dependen de la fricción o de una acción de corte mecánico que genera calor, el procedimiento de descompresión de nitrógeno va acompañado de una expansión adiabática que enfría la muestra en lugar de calentarla.

La capa de gas nitrógeno inerte que satura la suspensión celular y el homogeneizado ofrece protección contra la oxidación de los componentes celulares. Aunque en esta técnica se han utilizado otros gases: dióxido de carbono , óxido nitroso , monóxido de carbono y aire comprimido, se prefiere el nitrógeno por su naturaleza no reactiva y porque no altera el pH del medio de suspensión. Además, se prefiere el nitrógeno porque generalmente está disponible a bajo costo y a presiones adecuadas para este procedimiento.

Una vez liberadas, las sustancias subcelulares no quedan expuestas a un desgaste continuo que podría desnaturalizar la muestra o producir daños no deseados. No es necesario estar atento a un pico entre la actividad enzimática y el porcentaje de alteración. Dado que las burbujas de nitrógeno se generan dentro de cada célula, la misma fuerza de alteración se aplica uniformemente en toda la muestra, lo que garantiza una uniformidad inusual en el producto. Se pueden producir homogeneizados sin células.

La técnica se utiliza para homogeneizar células y tejidos, liberar orgánulos intactos , preparar membranas celulares , liberar sustancias bioquímicas lábiles y producir homogeneizados uniformes y repetibles sin someter la muestra a un estrés químico o físico extremo.

El método es particularmente adecuado para tratar células de mamíferos y otras células unidas a membranas. ^[14] También se ha utilizado con éxito para tratar células vegetales , para liberar virus de huevos fertilizados y para tratar bacterias frágiles . No se recomienda para células bacterianas no tratadas. Las levaduras , los hongos , las esporas y otros materiales con paredes celulares resistentes no responden bien a este método.

• Lisis
• Homogeneizador ultrasónico
• Sonicación
• Homogeneización (química)
• Homogeneizador