Didesoxinucleótido

Los didesoxinucleótidos son inhibidores de la elongación de la cadena de la ADN polimerasa , utilizados en el método Sanger para la secuenciación del ADN . ^[1] También se conocen como 2',3' porque tanto la posición 2' como la 3' de la ribosa carecen de grupos hidroxilo , y se abrevian como ddNTP (ddGTP, ddATP, ddTTP y ddCTP). ^[2]

El método de Sanger se utiliza para amplificar un segmento objetivo de ADN, de modo que la secuencia de ADN se pueda determinar con precisión. La incorporación de ddNTP en las válvulas de reacción se utiliza simplemente para terminar la síntesis de una cadena de ADN en crecimiento, lo que da como resultado fragmentos de ADN parcialmente replicados. Esto se debe a que la ADN polimerasa requiere el grupo OH 3' de la cadena en crecimiento y el grupo fosfato 5' del dNTP entrante para crear un enlace fosfodiéster . ^[2] A veces, la ADN polimerasa incorporará un ddNTP y la ausencia del grupo OH 3' interrumpirá la reacción de condensación entre el fosfato 5' (después de la escisión del pirofosfato ) del nucleótido entrante con el grupo hidroxilo 3' del nucleótido anterior en la cadena en crecimiento. Esta reacción de condensación normalmente ocurriría con la incorporación de un dNTP no modificado por la ADN polimerasa. En términos más simples, el ataque nucleofílico del grupo OH 3' conduce a la adición de un nucleótido a una cadena en crecimiento. La ausencia del grupo hidroxilo 3' inhibe que se produzca este ataque nucleofílico, lo que inhabilita la capacidad de la ADN polimerasa de continuar con su función. ^[2]

Este descubrimiento dio lugar a su nombre apropiado "nucleótidos de terminación de cadena". ^[2] Los didesoxirribonucleótidos no tienen un grupo hidroxilo 3', por lo que no puede producirse una mayor elongación de la cadena una vez que este didesoxinucleótido está en la cadena. Esto puede conducir a la terminación de la secuencia de ADN. Por lo tanto, estas moléculas forman la base del método de terminación de cadena didesoxi de secuenciación de ADN , que fue informado por Frederick Sanger y su equipo en 1977 ^[3] como una extensión de un trabajo anterior. ^[4] El enfoque de Sanger se describió en 2001 como uno de los dos métodos fundamentales para secuenciar fragmentos de ADN ^[1] (el otro es el método Maxam-Gilbert ^[5] ), pero el método de Sanger es tanto el "más utilizado como el método utilizado por la mayoría de los secuenciadores de ADN automatizados". ^[1] Sanger ganó su segundo Premio Nobel de Química en 1980, compartiéndolo con Walter Gilbert ("por sus contribuciones sobre la determinación de secuencias de bases en ácidos nucleicos") y con Paul Berg ("por sus estudios fundamentales de la bioquímica de los ácidos nucleicos, con especial atención al ADN recombinante "), ^[6] y discutió el uso de didesoxinucleótidos en su conferencia Nobel. ^[7]

Los didesoxinucleótidos son útiles en la secuenciación de ADN en combinación con la electroforesis . Una muestra de ADN que se somete a PCR ( reacción en cadena de la polimerasa ) en una mezcla que contiene los cuatro desoxinucleótidos y un didesoxinucleótido producirá cadenas de longitud igual a la posición de cada base del tipo que complementa el tipo que tiene un didesoxinucleótido presente. Que la polimerasa taq utilizada en PCR favorezca al ddGNTP, es un patrón observado en varias investigaciones. ^[8] Es decir, cada base de nucleótido de ese tipo particular tiene una probabilidad de estar unida no a un desoxinucleótido sino a un didesoxinucleótido, lo que termina la elongación de la cadena. Por lo tanto, si la muestra luego se somete a electroforesis, habrá una banda presente para cada longitud en la que esté presente el complemento del didesoxinucleótido. Ahora es común usar didesoxinucleótidos fluorescentes de modo que cada uno de los cuatro tenga una fluorescencia diferente que pueda ser detectada por un secuenciador; por lo tanto, solo se necesita una reacción.

En un método patentado, se utilizó tetrahidrofurano en un disolvente que contenía 50 g (0,205 moles) de uridina (o, presumiblemente, cualquier nucleósido no protegido ), 112 ml (1,03 moles) de ortoformiato de metilo y 10 g (52,6 mmoles) de ácido paratoluenosulfónico a temperatura ambiente con agitación. Después de agitar a temperatura ambiente durante 24 horas, la mezcla de reacción se vertió en una solución acuosa de bicarbonato de sodio seguido de extracción con cloroformo 5 veces. El extracto se secó sobre sulfato de sodio y se concentró para dar 49,5 g (0,173 moles) de 2',3'-o-metoximetilideneuridina (rendimiento, 84,5%). Después de esta reacción, el producto de ejemplo de uridina 2',3'-o-metoximetilideneuridina se disuelve a continuación en 50 ml de anhídrido acético a temperatura ambiente con agitación. La solución se calentó a 140 °C y se mantuvo a esta temperatura durante 5 horas bajo reflujo del disolvente. Después de enfriar a temperatura ambiente, el disolvente se eliminó por destilación a presión reducida, se añadieron 50 ml de agua y la mezcla se extrajo 3 veces con 100 ml de cloroformo. El extracto se concentró a presión reducida, agua amoniacal al 30% para obtener un rendimiento del 82,3% de 2',3'-didesoxi-2',3'-dideshidrouridina. A continuación, este ejemplo de producto se hidrata para eliminar el doble enlace disolviéndolo en metanol (10 ml) que contiene un catalizador (paladio húmedo al 5% sobre carbono) (400 mg) en una atmósfera de hidrógeno durante 1 h para obtener el didesoxinucleósido resultante (2',3'-didesoxiuridina en este caso). ^{[6] El} nucleótido colorante que se utilizará probablemente se obtendrá mediante el tratamiento con una enzima de fosforilación y biotinilación y la reacción de la sustancia biotinilada con el colorante. Es posible que también se produzca una reacción inmediata con el colorante, pero se afirma que la extensión del brazo aumenta la eficiencia en el caso de utilizar una forma mutante de la ADN polimerasa. ^[5]

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