Motivo adyacente al protoespaciador
Tipo de secuencia de ADN de pares de bases

Un motivo adyacente al protoespaciador ( PAM ) es una secuencia de ADN de 2 a 6 pares de bases que sigue inmediatamente a la secuencia de ADN a la que se dirige la nucleasa Cas9 en el sistema inmunológico adaptativo bacteriano CRISPR . [1] El PAM es un componente del virus o plásmido invasor, pero no se encuentra en el genoma del huésped bacteriano y, por lo tanto, no es un componente del locus CRISPR bacteriano . Cas9 no se unirá con éxito a la secuencia de ADN diana ni la escindirá si no va seguida de la secuencia PAM. [2] [3] [4] [5] El PAM es un componente de orientación esencial que distingue el ADN propio bacteriano del no propio, evitando así que la nucleasa asociada a CRISPR ataque y destruya el locus CRISPR. [6]

Espaciadores/protoespaciadores

En un genoma bacteriano, los loci CRISPR contienen "espaciadores" (ADN viral insertado en un locus CRISPR) que en los sistemas inmunitarios adaptativos de tipo II se crearon a partir de ADN viral o plasmídico invasor (llamados "protoespaciadores"). Tras una invasión posterior, una nucleasa asociada a CRISPR, como Cas9 , se une a un complejo tracrRNA - crRNA , que guía a Cas9 hasta la secuencia protoespaciadora invasora. Pero Cas9 no escindirá la secuencia protoespaciadora a menos que haya una secuencia PAM adyacente. El espaciador en los loci CRISPR bacterianos no contendrá una secuencia PAM y, por lo tanto, no será cortado por la nucleasa, pero el protoespaciador en el virus o plásmido invasor contendrá la secuencia PAM y, por lo tanto, será escindido por la nucleasa Cas9. [4] En las aplicaciones de edición del genoma , se sintetiza un oligonucleótido corto conocido como ARN guía (gRNA) para realizar la función del complejo tracrRNA–crRNA de reconocer secuencias genéticas que tienen una secuencia PAM en el extremo 3' , "guiando" así la nucleasa hacia una secuencia específica que la nucleasa es capaz de cortar. [7] [8]

Secuencias PAM

PAM y tamaño de varias nucleasas de ADN CRISPR

El PAM canónico es la secuencia 5'-NGG-3', donde "N" es cualquier nucleobase seguida de dos nucleobases de guanina ("G"). [9] Los ARN guía pueden transportar Cas9 a cualquier locus en el genoma para la edición genética, pero no puede ocurrir ninguna edición en ningún sitio que no sea uno en el que Cas9 reconoce PAM. El PAM canónico está asociado con la nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes (designada SpCas9), mientras que diferentes PAM están asociados con las proteínas Cas9 de las bacterias Neisseria meningitidis , Treponema denticola y Streptococcus thermophilus . [10] 5'-NGA-3' puede ser un PAM no canónico altamente eficiente para células humanas, pero la eficiencia varía con la ubicación del genoma. [11] Se han realizado intentos de diseñar Cas9 para reconocer diferentes PAM con el fin de mejorar la capacidad de CRISPR-Cas9 para editar genes en cualquier ubicación deseada del genoma. [12]

La Cas9 de Francisella novicida reconoce la secuencia PAM canónica 5'-NGG-3', pero ha sido diseñada para reconocer 5'-YG-3' (donde "Y" es una pirimidina [13] ), lo que aumenta el rango de posibles objetivos de Cas9. [14] La nucleasa Cpf1 de Francisella novicida reconoce el PAM 5'-TTTN-3' [15] o 5'-YTN-3'. [16]

Aparte de CRISPR-Cas9 y CRISPR-Cpf1, sin duda hay muchas otras nucleasas y PAM aún no descubiertos. [17]

CRISPR/Cas13a (anteriormente C2c2 [18] ) de la bacteria Leptotrichia shahii es un sistema CRISPR guiado por ARN que se dirige a secuencias de ARN en lugar de ADN. PAM no es relevante para un CRISPR dirigido al ARN, aunque una guanina que flanquea el objetivo afecta negativamente a la eficacia y se ha designado como un "sitio de flanqueo del protoespaciador" (PFS). [19]

GUIA-Seq

Se ha ideado una tecnología llamada GUIDE-Seq para analizar las escisiones no deseadas producidas por dicha edición genética. [20] El requisito de PAM se puede aprovechar para apuntar específicamente a mutaciones heterocigóticas de un solo nucleótido sin ejercer efectos aberrantes sobre los alelos de tipo salvaje. [21]

Véase también

  • Guía CRISPR-Cas de Addgene

Referencias

  1. ^ Shah SA, Erdmann S, Mojica FJ, Garrett RA (2013). "Motivos de reconocimiento de protoespaciadores: identidades mixtas y diversidad funcional". RNA Biology . 10 (5): 891–899. doi :10.4161/rna.23764. PMC  3737346 . PMID  23403393.
  2. ^ Mojica FJ, Díez-Villaseñor C, García-Martínez J, Almendros C (2009). "Las secuencias de motivos cortos determinan los objetivos del sistema de defensa CRISPR procariota". Microbiología . 155 (Pt 3): 733–740. doi : 10.1099/mic.0.023960-0 . PMID  19246744.
  3. ^ Shah SA, Erdmann S, Mojica FJ, Garrett RA (2013). "Motivos de reconocimiento de protoespaciadores: identidades mixtas y diversidad funcional". RNA Biology . 10 (5): 891–899. doi :10.4161/rna.23764. PMC 3737346 . PMID  23403393. Archivado desde el original el 4 de septiembre de 2014. 
  4. ^ ab Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E (2012). "Una endonucleasa de ADN programable guiada por ARN dual en la inmunidad bacteriana adaptativa". Science . 337 (6096): 816–821. Bibcode :2012Sci...337..816J. doi :10.1126/science.1225829. PMC 6286148 . PMID  22745249. 
  5. ^ Sternberg SH, Redding S, Jinek M, Greene EC, Doudna JA (2014). "Interrogación de ADN por la endonucleasa Cas9 guiada por ARN CRISPR". Nature . 507 (7490): 62–67. Bibcode :2014Natur.507...62S. doi :10.1038/nature13011. PMC 4106473 . PMID  24476820. 
  6. ^ Mali P, Esvelt KM, Church GM (2013). "Cas9 como una herramienta versátil para la biología de la ingeniería". Nature Methods . 10 (10): 957–963. doi :10.1038/nmeth.2649. PMC 4051438 . PMID  24076990. 
  7. ^ Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE, Norville JE, Church GM (2013). "Ingeniería del genoma humano guiada por ARN mediante Cas9". Science . 339 (6121): 823–826. Bibcode :2013Sci...339..823M. doi :10.1126/science.1232033. PMC 3712628 . PMID  23287722. 
  8. ^ Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA, Zhang F (2013). "Ingeniería genómica multiplexada utilizando sistemas CRISPR/Cas". Science . 339 (6121): 819–823. Bibcode :2013Sci...339..819C. doi :10.1126/science.1231143. PMC 3795411 . PMID  23287718. 
  9. ^ Anders C, Niewoehner O, Duerst A, Jinek M (2014). "Base estructural del reconocimiento de ADN diana dependiente de PAM por la endonucleasa Cas9". Nature . 513 (7519): 569–573. Bibcode :2014Natur.513..569A. doi :10.1038/nature13579. PMC 4176945 . PMID  25079318. 
  10. ^ Esvelt KM, Mali P, Braff JL, Moosburner M, Yaung SJ, Church GM (2013). "Proteínas Cas9 ortogonales para la regulación y edición de genes guiada por ARN". Nature Methods . 10 (11): 1116–1123. doi :10.1038/nmeth.2681. PMC 3844869 . PMID  24076762. 
  11. ^ Zhang Y, Ge X, Yang F, Zhang L, Zheng J, Tan X, Jin ZB, Qu J, Gu F (2014). "Comparación de PAM no canónicos para la escisión de ADN mediada por CRISPR/Cas9 en células humanas". Scientific Reports . 4 : 5405. Bibcode :2014NatSR...4E5405Z. doi :10.1038/srep05405. PMC 4066725 . PMID  24956376. 
  12. ^ Kleinstiver BP, Prew MS, Tsai SQ, Topkar VV, Nguyen NT, Zheng Z, Gonzales AP, Li Z, Peterson RT, Yeh JR, Aryee MJ, Joung JK (2015). "Nucleasas CRISPR-Cas9 diseñadas con especificidades PAM alteradas". Nature . 523 (7561): 481–485. Bibcode :2015Natur.523..481K. doi :10.1038/nature14592. PMC 4540238 . PMID  26098369. 
  13. ^ "Códigos de nucleótidos, códigos de aminoácidos y códigos genéticos". KEGG: Enciclopedia de Kioto de genes y genomas. 15 de julio de 2014. Consultado el 6 de abril de 2016 .
  14. ^ Hirano H, Gootenberg JS, Horii T, Abudayyeh OO, Kimura M, Hsu PD, Nakane T, Ishitani R, Hatada I, Zhang F, Nishimasu H, Nureki O (2016). "Estructura e Ingeniería de Francisella novicida Cas9". Celúla . 164 (5): 950–961. doi :10.1016/j.cell.2016.01.039. PMC 4899972 . PMID  26875867. 
  15. ^ Zetsche B, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Slaymaker IM, Makarova KS, Essletzbichler P, Volz SE, Joung J, van der Oost J, Regev A, Koonin EV, Zhang F (2015). "Cpf1 es una endonucleasa guiada por ARN único de un sistema CRISPR-Cas de clase 2". Cell . 163 (3): 759–771. doi :10.1016/j.cell.2015.09.038. PMC 4638220 . PMID  26422227. 
  16. ^ Fonfara I, Richter H, Bratovič M, Le Rhun A, Charpentier E (2016). "La enzima de corte de ADN asociada a CRISPR Cpf1 también procesa el ARN precursor de CRISPR". Nature . 532 (7600): 517–521. Bibcode :2016Natur.532..517F. doi :10.1038/nature17945. PMID  27096362. S2CID  2271552.
  17. ^ "Incluso CRISPR". The Economist . ISSN  0013-0613 . Consultado el 27 de mayo de 2016 .
  18. ^ Shmakov S, et al. (2017). "Diversidad y evolución de los sistemas CRISPR-Cas de clase 2". Nat. Rev. Microbiol. 15 (3): 169–182. doi :10.1038/nrmicro.2016.184. PMC 5851899 . PMID  28111461.  
  19. ^ Abudayyeh OO, Gootenberg JS, Konermann S, Joung J, Slaymaker IM, Cox DB, Shmakov S, Makarova KS, Semenova E, Minakhin L, Severinov K, Regev A, Lander ES, Koonin EV, Zhang F (2016). "C2c2 es un efector CRISPR de un solo componente programable y guiado por ARN dirigido por ARN". Science . 353 (6299): aaf5573. doi :10.1126/science.aaf5573. PMC 5127784 . PMID  27256883. 
  20. ^ Tsai SQ, Zheng Z, Nguyen NT, Liebers M, Topkar VV, Thapar V, Wyvekens N, Khayter C, Iafrate AJ, Le LP, Aryee MJ, Joung JK (2015). "GUIDE-seq permite la elaboración de perfiles de todo el genoma de la escisión fuera del objetivo mediante núcleos CRISPR-Cas". Nature Biotechnology . 33 (2): 187–197. doi :10.1038/nbt.3117. PMC 4320685 . PMID  25513782. 
  21. ^ Li Y, Mendiratta S, Ehrhardt K, Kashyap N, White MA, Bleris L (2016). "Explotación de la restricción PAM de CRISPR/Cas9 para intervenciones de resolución de un solo nucleótido". PLoS One . 11 (1): e0144970. Bibcode :2016PLoSO..1144970L. doi : 10.1371/journal.pone.0144970 . PMC 4720446 . PMID  26788852. 
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