Degradación de Edman

La degradación de Edman , desarrollada por Pehr Edman , es un método de secuenciación de aminoácidos en un péptido . ^[1] En este método, el residuo amino-terminal se marca y se separa del péptido sin alterar los enlaces peptídicos entre otros residuos de aminoácidos.

El isotiocianato de fenilo se hace reaccionar con un grupo amino N-terminal no cargado, en condiciones ligeramente alcalinas, para formar un derivado cíclico de feniltiocarbamoilo . Luego, en condiciones ácidas , este derivado del aminoácido terminal se escinde como un derivado de tiazolinona. Luego, el aminoácido tiazolinona se extrae selectivamente en un solvente orgánico y se trata con ácido para formar el derivado de aminoácido feniltiohidantoína (PTH) más estable que se puede identificar mediante cromatografía o electroforesis . Luego, este procedimiento se puede repetir nuevamente para identificar el siguiente aminoácido. Una desventaja importante de esta técnica es que los péptidos que se secuencian de esta manera no pueden tener más de 50 a 60 residuos (y en la práctica, menos de 30). La longitud del péptido es limitada debido a que la derivatización cíclica no siempre se completa. El problema de la derivatización se puede resolver escindiendo péptidos grandes en péptidos más pequeños antes de continuar con la reacción. Es capaz de secuenciar con precisión hasta 30 aminoácidos con máquinas modernas capaces de alcanzar una eficiencia de más del 99% por aminoácido . Una ventaja de la degradación de Edman es que solo utiliza entre 10 y 100 picomoles de péptido para el proceso de secuenciación. La reacción de degradación de Edman fue automatizada en 1967 por Edman y Beggs para acelerar el proceso ^[2] y en 1973 se utilizaban 100 dispositivos automatizados en todo el mundo. ^[3]

Debido a que la degradación de Edman procede del extremo N de la proteína, no funcionará si el extremo N ha sido modificado químicamente (por ejemplo, por acetilación o formación de ácido piroglutámico ). La secuenciación se detendrá si se encuentra un aminoácido que no sea α (por ejemplo, ácido isoaspártico ), ya que no se puede formar el intermedio de anillo de cinco miembros preferido. La degradación de Edman generalmente no es útil para determinar las posiciones de los puentes disulfuro. También requiere cantidades de péptidos de 1 picomol o más para obtener resultados discernibles. ^{[ cita requerida ]}

Después de la electroforesis en gel de poliacrilamida en 2D, las proteínas se pueden transferir a una membrana de transferencia de difluoruro de polivinilideno (PVDF) para su posterior análisis. Las degradaciones de Edman se pueden realizar directamente desde una membrana de PVDF. La secuenciación de residuos N-terminales que da como resultado de cinco a diez aminoácidos puede ser suficiente para identificar una proteína de interés (POI). ^{[ cita requerida ]}

• Degradación de Bergmann
• Cloruro de dansilo