Despirogenación

Este artículo incluye una lista de referencias generales , pero carece de suficientes citas en línea correspondientes . Por favor, ayude a mejorar este artículo introduciendo citas más precisas. ( Mayo de 2012 ) ( Aprenda cómo y cuándo eliminar este mensaje )

La despirogenación se refiere a la eliminación de pirógenos de las soluciones , más comúnmente de productos farmacéuticos inyectables.

Un pirógeno se define como cualquier sustancia que puede causar fiebre. Los pirógenos bacterianos incluyen endotoxinas y exotoxinas , aunque muchos pirógenos son endógenos al huésped. Las endotoxinas incluyen moléculas de lipopolisacárido (LPS) que se encuentran como parte de la pared celular de las bacterias gramnegativas y se liberan tras la lisis celular bacteriana . Las endotoxinas pueden volverse pirógenas cuando se liberan en el torrente sanguíneo u otros tejidos donde no se encuentran habitualmente. Aunque el colon contiene bacterias gramnegativas en abundancia, no causan un efecto pirógeno ya que las bacterias no sufren una lisis macroscópica y el sistema inmunitario no está expuesto a la endotoxina libre mientras la pared colónica está intacta.

Cuando el LPS se libera tras la lisis de las células bacterianas, el componente lipídico A se une primero a la proteína de unión a LPS (LBP) sérica y luego se transfiere a CD14 (ya sea CD14 libre en el suero o unido a la superficie celular de los macrófagos o monocitos). Esto monomeriza el LPS agregado, ya que el receptor de LPS Toll-like Receptor 4 (TLR4) no puede reconocer el LPS mientras está agregado. El LPS monomérico se transfiere entonces a MD-2 precomplejado con TLR4 en macrófagos y monocitos . Esto conduce a la liberación de citocinas proinflamatorias y óxido nítrico, lo que puede conducir en última instancia a un choque séptico dependiendo de la fuerza de la respuesta. Las células endoteliales vasculares también expresan TLR4 y MD-2 y, por lo tanto, responden al LPS directamente, así como a través de citocinas y óxido nítrico. Las células epiteliales bronquiales y las células epiteliales colónicas también expresan TLR4, pero como no expresan MD-2, dependen del LPS precomplejado con MD-2 sérico para enviar señales al LPS.

Debido a que el peso molecular de las endotoxinas puede variar mucho (entre 10 000 y 1 000 000 Da), los niveles de endotoxinas se miden en "unidades de endotoxina" (UE). Una UE equivale aproximadamente a 100 pg de lipopolisacárido de E. coli, la cantidad presente en alrededor de 10 ⁵ bacterias. Los seres humanos pueden desarrollar síntomas cuando se exponen a tan solo 5 UE/kg de peso corporal. Estos síntomas incluyen, entre otros, fiebre, presión arterial baja, aumento de la frecuencia cardíaca y baja producción de orina; e incluso pequeñas dosis de endotoxina en el torrente sanguíneo suelen ser fatales.

La Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos ha establecido los siguientes niveles máximos permisibles de endotoxinas para los medicamentos distribuidos en los Estados Unidos:

• Fármaco (inyectable, intratecal ): 0,2 UE/kg de peso corporal
• Fármaco (inyectable, no intratecal): 5 UE/kg de peso corporal
• Agua esterilizada: 0,25-0,5 EU/ml (depende del uso previsto)

La detección temprana de endotoxinas se logró inyectando la muestra a conejos y observando la respuesta de su temperatura corporal. Los conejos tienen una tolerancia a las endotoxinas similar a la de los humanos, por lo que eran una opción ideal. Sin embargo, este método era costoso, requería mucho tiempo y provocó protestas de los defensores de los derechos de los animales. Pero quizás el mayor inconveniente de esta prueba fue su incapacidad para cuantificar el nivel de endotoxinas.

Actualmente, un método común para la detección de endotoxinas es la prueba del lisado de amebocitos de Limulus (LAL). Esta prueba se basa en la observación del Dr. Frederik Bang de que la sangre del cangrejo herradura forma coágulos cuando se expone a endotoxinas. ^[1] El extracto de amebocitos de la sangre del cangrejo herradura se mezcla con una muestra sospechosa de contaminación por endotoxinas, y se observa una reacción si hay endotoxinas presentes. La FDA ha aprobado cuatro variaciones de la prueba LAL: gel-clot, turbidimétrico, colorimétrico y cromogénico. Las diferencias en estas variaciones se refieren a las características de la reacción amebocitos/endtoxina (por ejemplo, el gel-clot produce un precipitado y el colorimétrico cambia de color). Esta prueba es rápida (aproximadamente 30 minutos) y altamente sensible (hasta 0,001 EU/ml de sensibilidad). Sin embargo, debido a que solo detecta endotoxinas LPS, algunos materiales pirogénicos pueden pasarse por alto. Además, ciertas condiciones (condiciones de pH subóptimas o concentración inadecuada de cationes ) pueden dar lugar a falsos negativos. Los glucanos de las matrices de cromatografía de carbohidratos también pueden dar lugar a falsos positivos. ^[2]

Desde 2003, se encuentra disponible comercialmente un sustituto sintético de la prueba LAL. Esta prueba de factor C recombinante (rFC) se basa en el factor de coagulación C de Limulus , la parte sensible a LPS de LAL. La adopción de esta prueba fue lenta, lo que comenzó a cambiar en 2016 cuando la Farmacopea Europea incluyó esta prueba como una prueba de toxina bacteriana aceptada. ^[3]

La prueba de activación de monocitos (MAT) utiliza los monocitos de la sangre humana in vitro para detectar pirógenos. Se agregó a la Farmacopea Europea en 2010 y fue aceptada por la FDA en 2012. ^[4]

Los pirógenos suelen ser difíciles de eliminar de una solución debido a la alta variabilidad de su peso molecular. Además, son relativamente estables térmicamente e insensibles a los cambios de pH. Sin embargo, existen varias técnicas de eliminación. ^[5]

Las endotoxinas tienen carga negativa y se unirán a un intercambiador de aniones . Si la sustancia objetivo no tiene carga negativa, pasará por la columna antes que la endotoxina y se puede lograr una separación eficaz. Este método se utiliza a veces en la purificación de albúminas (los detalles siguen). Los ligandos de afinidad conocida por las endotoxinas se pueden acoplar a un sistema de intercambio aniónico para aumentar su fuerza de unión a las endotoxinas y mejorar aún más la pureza del producto final. Los ejemplos típicos de ligandos de unión a endotoxinas incluyen histamina , compuestos heterocíclicos que contienen nitrógeno y polimixina B. Sin embargo, se sabe que la polimixina B induce la producción de interleucina-1, un pirógeno exógeno, y por lo tanto se debe demostrar que está ausente en el producto final si se usa.

Ejemplo de uso de cromatografía de intercambio aniónico para purificar albúmina: ^[6]

• El 2 % de la endotoxina no se une a la columna. Sin embargo, este 2 % se elimina antes del pico de albúmina y, por lo tanto, se puede eliminar simplemente iniciando la recolección después de que se haya eliminado este 2 %.
• El 10 % de la endotoxina que se une a la columna (el 9,8 % del total original) se eliminará después del pico de albúmina. Se puede evitar que esto ingrese al producto final deteniendo la recolección antes de que esto suceda.
• El 90% restante de la endotoxina unida (88,2% del total original) debe limpiarse de la columna utilizando NaOH.

Una alternativa al intercambio aniónico es la cromatografía de intercambio catiónico , en la que los solutos cargados positivamente se unen al medio cromatográfico sólido. En este método, el objetivo se une a la columna en lugar de la endotoxina. Luego, la endotoxina se filtra a través de la columna y, posteriormente, se eluye un objetivo puro de la columna. Se ha demostrado que la cromatografía de intercambio catiónico purifica eficazmente el β-interferón (Dembinski, et al.) ^[7].

Debido a que el peso molecular de las endotoxinas suele ser superior a 10 kD, la ultrafiltración a veces se puede utilizar para realizar una separación basada en el tamaño. Debido a la alta variabilidad del tamaño de las endotoxinas, puede resultar difícil seleccionar la membrana correcta, por lo que este método se utiliza mejor solo cuando todas las endotoxinas presentes tienen un tamaño superior a 300 000 Da. Se ha demostrado que los ultrafiltros disponibles comercialmente eliminan los pirógenos a un nivel inferior a 0,001 EU/ml. ^{[ cita requerida ]}

Este método también se basa en el gran peso molecular y la estabilidad térmica de las endotoxinas. Los disolventes de bajo peso molecular se pueden purificar fácilmente hirviéndolos y recogiendo el vapor condensado en un recipiente libre de endotoxinas (véase "calentamiento" a continuación). Las moléculas grandes de LPS no se vaporizan fácilmente y, por lo tanto, quedan en el recipiente de calentamiento. Este es el método de elección para la purificación del agua.

Debido a que los pirógenos suelen ser difíciles de eliminar, a veces puede ser preferible la inactivación o destrucción de la molécula de LPS.

Se ha demostrado que este método escinde el lípido A del polisacárido en la molécula de LPS (ver a la derecha). La fracción lipídica por sí sola no es soluble en agua. Por lo tanto, al no poder unirse a las células endoteliales , se vuelve inactiva. Sin embargo, la hidrólisis ácido-base puede desnaturalizar una proteína objetivo y, por lo tanto, no es adecuada para purificar una proteína.

La oxidación con peróxido de hidrógeno se utiliza a menudo como una solución de bajo coste para la destrucción de pirógenos. Se desconoce el mecanismo de esta destrucción, pero el peróxido de hidrógeno se puede eliminar fácilmente en etapas posteriores del proceso de purificación y, por tanto, es un método útil para la eliminación de pirógenos. Sin embargo, al igual que la hidrólisis ácido-base, no es adecuado para la purificación de proteínas.

Los métodos de calentamiento se utilizan a menudo para garantizar que el vidrio y otros equipos de laboratorio estén libres de material pirogénico. El calor se aplica mediante cocción en un horno de calor seco que está diseñado específicamente para el proceso de despirogenación. Aunque las endotoxinas son relativamente estables térmicamente, un calentamiento suficiente (250 °C durante 30 min) da como resultado una reducción de 3 log de los niveles de endotoxinas. Debido a los altos niveles de temperatura, este método tampoco es adecuado para purificar proteínas.

Para purificar proteínas, se pueden utilizar de forma segura y eficaz álcalis como el hidróxido de sodio (NaOH). También se utiliza ampliamente para la despirogenación de equipos no esterilizables en autoclave (por ejemplo, plásticos) y columnas de cromatografía. De hecho, cuando se utiliza un intercambiador de aniones para eliminar pirógenos, es necesario limpiar la columna con NaOH después de cada lote.

Dado que prácticamente todas las materias primas que intervienen en un proceso de producción, incluidos los empleados de la fábrica, pueden ser fuentes potenciales de contaminación por pirógenos, la selección y despirogenación de las materias primas puede ser de gran ayuda para garantizar que el producto final esté libre de pirógenos y no requiera métodos costosos de eliminación o inactivación. La ultrafiltración de productos químicos y soluciones tampón, la aplicación de prácticas de higiene adecuadas y la realización de pruebas periódicas pueden resultar útiles.

• Endotoxin
• Procesamiento posterior

• Sofer, G.; Hagel, L. (1997). Manual de cromatografía de procesos: una guía para la optimización, el escalamiento y la validación. Academic Press, 158-161. ISBN 0-12-654266-X 
• Tours, N. y Sandle, T. Comparación de la despirogenación con calor seco utilizando tres tipos diferentes de endotoxina bacteriana gramnegativa, European Journal of Parenteral and Pharmaceutical Sciences, volumen 13, n.º 1, 2008, págs. 17-20

• Actualización de LAL
• Actualización de la despirogenación LAL
• Oficina de Asuntos Regulatorios de la FDA: Guía técnica de inspección, endotoxinas/pirógenos bacterianos
• Libro de texto de bacteriología
• Usos médicos del cangrejo herradura
• Un enfoque práctico para los estudios de despirogenación utilizando endotoxinas bacterianas