Polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados
El polimorfismo de longitud de fragmento amplificado ( AFLP-PCR o AFLP ) es una herramienta basada en PCR utilizada en la investigación genética , la huella de ADN y en la práctica de la ingeniería genética . Desarrollado a principios de la década de 1990 por KeyGene, [1] AFLP utiliza enzimas de restricción para digerir el ADN genómico , seguido de la ligadura de adaptadores a los extremos pegajosos de los fragmentos de restricción . Luego, se selecciona un subconjunto de los fragmentos de restricción para ser amplificados. Esta selección se logra utilizando cebadores complementarios a la secuencia del adaptador, la secuencia del sitio de restricción y algunos nucleótidos dentro de los fragmentos del sitio de restricción (como se describe en detalle a continuación). Los fragmentos amplificados se separan y visualizan al desnaturalizarlos en una electroforesis en gel de agarosa , ya sea a través de autorradiografía o metodologías de fluorescencia , o mediante instrumentos de secuenciación capilar automatizados.
Aunque AFLP no debe utilizarse como acrónimo, se lo conoce comúnmente como "polimorfismo de longitud de fragmento amplificado". Sin embargo, los datos resultantes no se califican como polimorfismos de longitud, sino como polimorfismos de presencia-ausencia. [2]
La PCR-AFLP es un método de alta sensibilidad para detectar polimorfismos en el ADN . La técnica fue descrita originalmente por Vos y Zabeau en 1993. [3] [2] En detalle, el procedimiento de esta técnica se divide en tres pasos:
- Digestión del ADN celular total con una o más enzimas de restricción y ligadura de adaptadores específicos del medio sitio de restricción a todos los fragmentos de restricción.
- Amplificación selectiva de algunos de estos fragmentos con dos cebadores de PCR que tienen secuencias adaptadoras y sitios de restricción específicos correspondientes.
- Separación electroforética de amplicones en una matriz de gel, seguida de visualización del patrón de bandas.
Aplicaciones
La tecnología AFLP tiene la capacidad de detectar varios polimorfismos en diferentes regiones genómicas simultáneamente. También es muy sensible y reproducible. Como resultado, la AFLP se ha utilizado ampliamente para la identificación de variación genética en cepas o especies estrechamente relacionadas de plantas, hongos, animales y bacterias. La tecnología AFLP se ha utilizado en pruebas criminales y de paternidad, también para determinar pequeñas diferencias dentro de las poblaciones y en estudios de ligamiento para generar mapas para el análisis de locus de rasgos cuantitativos (QTL).
El AFLP tiene muchas ventajas en comparación con otras tecnologías de marcadores, como el ADN polimórfico amplificado aleatoriamente ( RAPD ), el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) y los microsatélites . El AFLP no solo tiene una mayor reproducibilidad, resolución y sensibilidad a nivel de todo el genoma en comparación con otras técnicas, [4] sino que también tiene la capacidad de amplificar entre 50 y 100 fragmentos a la vez. Además, no se necesita información de secuencia previa para la amplificación (Meudt y Clarke 2007). [5] Como resultado, el AFLP se ha vuelto extremadamente beneficioso en el estudio de taxones que incluyen bacterias, hongos y plantas, donde aún se desconoce mucho sobre la composición genómica de varios organismos.
La tecnología AFLP está cubierta por patentes y solicitudes de patentes de Keygene NV AFLP es una marca registrada de Keygene NV
Referencias
- ^ "Keygene.com" . Consultado el 10 de febrero de 2013 .
- ^ ab Vos P, Hogers R, Bleeker M, et al. (noviembre de 1995). "AFLP: una nueva técnica para la identificación de ADN". Nucleic Acids Res . 23 (21): 4407–14. doi :10.1093/nar/23.21.4407. PMC 307397 . PMID 7501463.
- ^ Zabeau, M y P. Vos. 1993. Amplificación selectiva de fragmentos de restricción: un método general para la identificación de ADN. Oficina Europea de Patentes, publicación 0 534 858 A1, boletín 93/13.
- ^ Mueller UG, Wolfenbarger LL (octubre de 1999). "Genotipado y huellas dactilares de AFLP". Trends Ecol. Evol . 14 (10): 389–394. CiteSeerX 10.1.1.115.2957 . doi :10.1016/S0169-5347(99)01659-6. PMID 10481200.
- ^ Meudt HM, Clarke AC (marzo de 2007). "¿Práctica casi olvidada o más reciente? Aplicaciones, análisis y avances de AFLP". Trends Plant Sci . 12 (3): 106–17. doi :10.1016/j.tplants.2007.02.001. PMID 17303467.
Enlaces externos
Software para analizar datos AFLP
- Electroforesis automatizada CLIQS 1D Pro (en gel o capilar), coincidencia de bandas y creación de bases de datos de fragmentos de AFLP
- BioNumerics Gelcompar II (descontinuado [1] ) Una plataforma universal para administrar y analizar todos sus datos biológicos, incluido AFLP
- KeyGene Quantar Suite Software de puntuación de marcadores versátil
- Software de análisis de fragmentos GeneMarker de SoftGenetics
Software gratuito para analizar datos AFLP
- SourceForge Genographer Software gratuito para puntuación manual (aplicación Java)
- Puntuación automática gratuita de SourceForge RawGeno (entorno R CRAN, que incluye una interfaz gráfica de usuario fácil de usar)
Programas en línea para simulación de AFLP-PCR
- ALFIE - BProcariotas o secuencias cargadas
- PCR-AFLP in silico para procariotas, algunos eucariotas o secuencias cargadas
- Enzimas para AFLP New England Biolabs
- Nota sobre tecnología AFLP en KeyGene
- Aplicaciones de AFLP
- ^ "Atención a todos los usuarios de GelCompar II". 8 de mayo de 2018.
