Identificación de la adenina metiltransferasa del ADN

La identificación de la metiltransferasa de ADN , a menudo abreviada como DamID , ^[1] es un protocolo de biología molecular utilizado para mapear los sitios de unión de las proteínas de unión al ADN y a la cromatina en eucariotas . DamID identifica los sitios de unión expresando la proteína de unión al ADN propuesta como una proteína de fusión con la metiltransferasa de ADN . La unión de la proteína de interés al ADN localiza la metiltransferasa en la región del sitio de unión. La metilación de la adenina no ocurre de forma natural en los eucariotas y, por lo tanto, se puede concluir que la metilación de la adenina en cualquier región ha sido causada por la proteína de fusión, lo que implica que la región está ubicada cerca de un sitio de unión. DamID es un método alternativo a ChIP-on-chip o ChIP-seq . ^[2]

La N6-metiladenina (m6A) es el producto de la adición de un grupo metilo (CH ₃ ) en la posición 6 de la adenina. Este nucleótido modificado está ausente en la gran mayoría de los eucariotas, con la excepción de C. elegans , ^[3] pero está ampliamente distribuido en los genomas bacterianos, ^[4] como parte de los sistemas de modificación de restricción o reparación del ADN . En Escherichia coli , la metilación de la adenina es catalizada por la adenina metiltransferasa Dam (ADN adenina metiltransferasa), que cataliza la metilación de la adenina exclusivamente en la secuencia palindrómica GATC. La expresión ectópica de Dam en células eucariotas conduce a la metilación de la adenina en secuencias GATC sin ningún otro efecto secundario notable.

En base a esto, DamID consiste en fusionar Dam a una proteína de interés (normalmente una proteína que interacciona con el ADN como los factores de transcripción ) o a un componente de la cromatina. La proteína de interés dirige así a Dam a su sitio de unión cognado in vivo , lo que da lugar a la metilación de los GATC vecinos. La presencia de m6A, coincidente con los sitios de unión de las proteínas de interés, se revela mediante PCR de metilo .

En este ensayo, el genoma es digerido por DpnI , que corta solo los GATC metilados. A continuación, los adaptadores bicatenarios con una secuencia conocida se ligan a los extremos generados por DpnI. A continuación, los productos de la ligación son digeridos por DpnII . Esta enzima corta los GATC no metilados, lo que garantiza que solo los fragmentos flanqueados por GATC metilados consecutivos se amplifiquen en la PCR posterior. A continuación, se lleva a cabo una PCR con cebadores que coinciden con los adaptadores, lo que conduce a la amplificación específica de los fragmentos genómicos flanqueados por GATC metilados.

La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es un método alternativo para analizar la unión de proteínas en loci específicos del genoma. A diferencia de ChIP, DamID no requiere un anticuerpo específico contra la proteína de interés. Por un lado, esto permite mapear proteínas para las que no hay tal anticuerpo disponible. Por otro lado, esto hace imposible mapear específicamente proteínas modificadas postraduccionalmente .

Otra diferencia fundamental es que el ChIP analiza dónde se encuentra la proteína de interés en un momento dado, mientras que el DamID analiza dónde ha estado . La razón es que m6A permanece en el ADN después de que la proteína de fusión Dam desaparezca. Para las proteínas que están unidas o no a sus sitios objetivo, esto no cambia el panorama general. Sin embargo, esto puede conducir a fuertes diferencias en el caso de las proteínas que se deslizan a lo largo del ADN ( por ejemplo, la ARN polimerasa).

Dependiendo de cómo se lleve a cabo el experimento, DamID puede estar sujeto a sesgos de metilación de plásmidos. Debido a que los plásmidos generalmente se amplifican en E. coli donde Dam se expresa de forma natural, se metilan en cada GATC. En experimentos de transfección transitoria , el ADN de esos plásmidos se recupera junto con el ADN de las células transfectadas, lo que significa que los fragmentos del plásmido se amplifican en la PCR de metilación. Por lo tanto, cada secuencia del genoma que comparte homología o identidad con el plásmido puede parecer estar unida a la proteína de interés. En particular, esto es cierto para el marco de lectura abierto de la proteína de interés, que está presente tanto en el plásmido como en el genoma. En experimentos de microarrays , este sesgo se puede utilizar para garantizar que se haya hibridado el material adecuado. En líneas celulares estables o animales completamente transgénicos, este sesgo no se observa ya que no se recupera ADN plasmídico.

Las células apoptóticas degradan su ADN siguiendo un patrón característico de escalera de nucleosomas. Esto genera fragmentos de ADN que pueden ligarse y amplificarse durante el procedimiento DamID (laboratorio de van Steensel, observaciones no publicadas). Se desconoce la influencia de estos fragmentos nucleosómicos en el perfil de unión de una proteína.

La resolución de DamID es una función de la disponibilidad de secuencias GATC en el genoma. Una proteína solo puede ser mapeada dentro de dos sitios GATC consecutivos. El espaciamiento medio entre fragmentos GATC es de 205 pb en Drosophila (FlyBase release 5), 260 en ratón (Mm9) y 460 en humano (HG19). Se puede utilizar un protocolo modificado (DamIP), que combina la inmunoprecipitación de m6A con una variante de Dam con un reconocimiento de sitio diana menos específico, para obtener datos de mayor resolución. ^[5]

Una ventaja importante de DamID sobre ChIP seq es que se puede analizar el perfil de los sitios de unión de proteínas en un tipo de célula particular in vivo sin necesidad de separar físicamente una subpoblación de células. Esto permite la investigación de procesos fisiológicos o de desarrollo en modelos animales.

El enfoque de DamID dirigido (TaDa) utiliza el fenómeno de la reiniciación del ribosoma para expresar proteínas de fusión Dam en niveles apropiadamente bajos para DamID (es decir, Dam no es saturante, evitando así la toxicidad). Esta construcción se puede combinar con promotores específicos del tipo de célula, lo que da como resultado una metilación específica del tejido. ^{[6] [7]} Este enfoque se puede utilizar para analizar la unión del factor de transcripción en un tipo de célula de interés o, alternativamente, dam se puede fusionar con subunidades de Pol II para determinar la unión de la ARN polimerasa y, por lo tanto, inferir la expresión génica específica de la célula. DamID dirigido se ha demostrado en células de Drosophila y ratón ^{[8] [9] .}

La DamID específica de la célula también se puede lograr mediante la escisión mediada por recombinación de un casete terminador transcripcional aguas arriba de la proteína de fusión Dam. ^[10] El casete terminador está flanqueado por sitios de recombinación FRT que se pueden eliminar cuando se combinan con la expresión específica de tejido de la recombinasa FLP . Tras la eliminación del casete, la fusión Dam se expresa a niveles bajos bajo el control de un promotor basal.

Además de la detección de interacciones estándar proteína-ADN, DamID se puede utilizar para investigar otros aspectos de la biología de la cromatina.

Este método se puede utilizar para detectar la unión conjunta de dos factores al mismo locus genómico . La metilasa Dam se puede expresar en dos mitades que se fusionan a diferentes proteínas de interés. Cuando ambas proteínas se unen a la misma región de ADN, la enzima Dam se reconstituye y es capaz de metilar los sitios GATC circundantes. ^[11]

Debido a la alta actividad de la enzima, la expresión de Dam no ligado da como resultado la metilación de todas las regiones de cromatina accesible. ^{[12] [13]} Este enfoque se puede utilizar como una alternativa a ATAC-seq o DNAse-seq . Cuando se combina con métodos DamID específicos del tipo de célula, la expresión de Dam no ligado se puede utilizar para identificar regiones promotoras o potenciadoras específicas del tipo de célula.

Se puede utilizar una variante de DamID conocida como RNA-DamID para detectar interacciones entre moléculas de ARN y ADN. ^[14] Este método se basa en la expresión de una proteína de fusión Dam-MCP que es capaz de unirse a un ARN que ha sido modificado con bucles de tallo MS2 . La unión de la proteína de fusión Dam al ARN da como resultado una metilación detectable en los sitios de unión del ARN al genoma.

Las secuencias de ADN distales a un sitio de unión de proteínas pueden acercarse físicamente mediante la formación de bucles en los cromosomas. Por ejemplo, estas interacciones median la función potenciadora y promotora . Estas interacciones pueden detectarse mediante la acción de la metilación de Dam. Si Dam se dirige a un locus de ADN conocido específico, los sitios distales que se acerquen debido a la configuración 3D del ADN también se metilarán y podrán detectarse como en la DamID convencional. ^[15]

La DamID se realiza generalmente en alrededor de 10.000 células ^[16] (aunque se ha demostrado con menos ^[6] ). Esto significa que los datos obtenidos representan la unión promedio o la probabilidad de un evento de unión en esa población de células. También se ha desarrollado un protocolo DamID para células individuales y se ha aplicado a células humanas ^[17] . Los enfoques de células individuales pueden resaltar la heterogeneidad de las asociaciones de cromatina entre células.

• Preguntas frecuentes sobre DamID